天然药物金纳多诱导人脂肪间充质干细胞神经向分化的浓度优化条件研究

发布时间：2017-12-13 21:21

本文关键词：天然药物金纳多诱导人脂肪间充质干细胞神经向分化的浓度优化条件研究

【摘要】：目的观察金纳多注射液能否在体外促进人脂肪间充质干细胞（humanadipose-derived stem cells，hADSCs）向神经元样细胞分化，并探索其安全、有效的最佳诱导浓度，使这种为人熟知的良药有望在新的干细胞领域为人类神经损伤或退行性疾病的治疗发挥更重要的作用。方法本研究分为两部分进行：（1）采用消化法分离纯化hADSCs，通过倒置显微镜观察细胞形态，流式细胞仪检测hADSCs的表面抗原（CD13，CD34，CD45，CD90，CD106），检测hADSCs体外成脂肪、成骨分化能力的方法，对hADSCs进行鉴定，并进行体外培养及扩增。（2）配制含金纳多药物浓度分别为0.3、0.6、1.3、1.9和2.6g/L的5组含药培养基和不含药正常培养基，分别对hADSCs进行诱导分化。倒置显微镜下观察不同药物浓度在不同时间点作用于细胞的形态变化，诱导至第14d时采用免疫荧光染色技术检测神经元骨架蛋白微管相关蛋白-2（microtubule-associated protein2，MAP-2）、神经生长相关蛋白-43（growthassociated protein-43，GAP-43）、突触功能蛋白突触素（synaptophysin，Syn）、神经细胞功能活性的形态指标尼氏小体（Nissl Body）的表达情况；MTT法检测0.3-2.6g/L之间8组浓度的金纳多对hADSCs作用后的细胞活性曲线；确定金纳多是否具有神经向诱导作用及其发挥作用的安全浓度范围。优化浓度条件，选择1.6g/L浓度组为主要对象进行检测和验证。流式细胞仪检测1.3-2.6g/L之间4组浓度的金纳多对hADSCs细胞凋亡率的影响，倒置显微镜下观察在不同时间点细胞的形态变化，分别于诱导后第3d、7d、10d、14d、21d采用细胞免疫荧光化学法检测神经前体细胞特异性标记物神经巢蛋白（Nestin）、MAP-2、GAP-43、Syn、Nissl和神经胶质细胞特异性标记物胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidicprotein，GFAP）的表达情况，计算阳性细胞率。结果（1）体外分离培养的hADSCs稳定传代后形态呈长梭形，旋涡状生长，可稳定扩增15代以上并高表达ADSCs表面抗原CD90、CD13，而淋巴和造血系细胞标志CD34,、CD45、CD106均呈低表达；成脂肪诱导30d后可见脂滴生成，成骨诱导30d后可见矿化结节形成；所提取和培养的细胞可鉴定为hADSCs。（2）经金纳多低浓度（0.3g/L、0.6g/L、1.3g/L）组诱导后的hADSCs形态在短暂的神经元样形态改变后，恢复至原长梭形形态；高浓度（1.9g/L、2.6g/L）组诱导后的hADSCs具有神经元的典型形态并可保持稳定。诱导后14d神经标记物染色结果显示：低浓度（0.3g/L、0.6g/L、1.3g/L）组各个标记物表达均为阴性；高浓度（1.9g/L、2.6g/L）组各标记物也均呈阳性表达，但细胞稀少。MTT法检测金纳多作用后hADSCs细胞活性曲线显示：低浓度（0.3g/L-1.6g/L）组细胞活性与对照组相比无显著性差异（P0.05），各组间相比无差异性（P0.05）；高浓度（1.9g/L-2.6g/L）组与对照组相比有显著性差异（P0.01），各组间相比无差异性（P0.05）；低浓度组与高浓度组各组间相比均有显著性差异（P0.01）。流式细胞仪检测诱导后细胞凋亡率显示：1.6g/L组活性细胞数与对照组相差不大；1.9g/L组细胞活性明显降低，并于诱导后第3天开始凋亡。结果说明高浓度组显著抑制细胞的生长活性，甚至诱导其凋亡；由以上结果确定金纳多发挥其诱导作用的有效、安全浓度范围为1.3g/LX1.9g/L。优化选取1.6g/L浓度组进行检测和验证，发现1.6g/L组可诱导hADSCs呈现并稳定保持典型神经元形态，即细胞呈双极或多极、并有突触样结构形成并在细胞间构成类似神经网络状连接。免疫荧光检测结果显示，1.6g/L浓度组在整个诱导过程中均持续表达神经元标记物Nestin、MAP-2、Syn、GAP-43、Nissl，而神经胶质细胞标记物GFAP仅有短暂微弱表达。结论（1）金纳多作为单一诱导剂可诱导hADSCs向神经元样细胞分化，不促进向星形胶质细胞分化，且其诱导作用具有浓度依赖性；（2）低浓度（1.3g/L及其以下）对hADSCs生长活性和神经向分化均无明显影响；（3）高浓度（1.9g/L及其以上）对hADSCs可发挥神经向诱导作用，，但明显抑制其生长活性，随着浓度的增高甚至促进其凋亡；（4）1.6g/L浓度的金纳多可稳定诱导hADSCs向神经元样细胞分化，同时可保持细胞的生长活性，故金纳多用于hADSCs神经向诱导分化的最佳浓度为1.6g/L。
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329.2

【参考文献】

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1 黄洁;张宜;杜少辉;陈东风;黎晖;周健洪;;牛珀至宝微丸对骨髓间充质干细胞移植后转分化为神经元的影响[J];中华中医药杂志;2005年12期

2 段晓慧;潘晓明;郭棱棱;赖真;;黄芪注射液加红花注射液对脑缺血再灌注大鼠BDNF的影响[J];成都中医药大学学报;2009年01期

3 刘建军;姚忠祥;秦茂林;陈兴书;陈建芳;;单味黄芪红花丹参注射液对神经干细胞分化影响的初步研究[J];第三军医大学学报;2006年14期

4 孙晓龙;李青;;脂肪干细胞的研究及临床应用进展[J];第四军医大学学报;2009年09期

5 苏平;黄建华;雒晓东;黄培新;黄燕;裴雪涛;;银杏内酯B对骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞的影响[J];广东医学;2007年01期

6 邓常青,王沙燕,王敏,唐映红,贺福元;补阳还五汤及其有效部位组方对沙土鼠脑缺血后反应性星形胶质细胞活化的影响[J];湖南中医学院学报;2001年04期

7 孙晋浩,杨琳,高英茂,李振华,底秀敏;补阳还五汤对神经干细胞生长分化的影响[J];山东大学学报(医学版);2002年05期

8 李文涛;汪洋;施慧芬;李如奎;路煜;;止颤汤对神经干细胞向多巴胺能神经元诱导分化作用的研究[J];世界科学技术（中医药现代化）;2009年03期

9 马廉,冯学永,杨立业,谢庆东,罗敏洁,黄天华;丹参诱导人脐血间充质干细胞分化为神经样细胞[J];实用儿科临床杂志;2005年11期

10 黄璞,刘力强,韩勇,曾莹;银杏叶提取物对中枢神经系统药理作用的研究进展[J];中国医院药学杂志;2005年06期