靶向LOX-1基因RNAi慢病毒载体的构建及其对内皮细胞凋亡的影响

发布时间：2017-12-14 19:00

  本文关键词：靶向LOX-1基因RNAi慢病毒载体的构建及其对内皮细胞凋亡的影响

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【摘要】：目的 1、构建靶向凝集素样氧化性低密度脂蛋白受体(Lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1, LOX-1)基因的RNA干扰(RNA interference, RNAi)慢病毒载体,包装病毒筛选最佳沉默靶点。 2、研究沉默LOX-1表达后对氧化性低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein, ox-LDL)诱导的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)凋亡的影响。 方法 1、针对LOX-1基因(OLR1)设计并合成3条siRNA干扰靶序列,与双酶切的线性U6-vshRNA-CMV-GFP慢病毒载体连接得到重组载体,并与包装辅助质粒共转染293T细胞获得慢病毒颗粒,逐步稀释法测定病毒滴度。 2、通过实验测得最佳感染指数(multiplicity of infection, MOI)及转染条件,按照分组：未转染病毒组(CON组),病毒阴性对照转染组(LV-NC组),病毒阳性转染组(LV-OLR1-RNAi-1组,LV-OLR1-RNAi-2组,LV-OLR1-RNAi-3组)转染HUVECs,转染96h后通过RT-PCR和Western Blotting分别检测LOX-1mRNA及蛋白的表达情况,筛选最佳干扰靶序列。 3、采用方法2中筛选的最佳干扰靶序列,按照分组：正常对照组,ox-LDL处理组,ox-LDL+LV-NC慢病毒转染组,ox-LDL+LV-OLR1-最佳干扰序列慢病毒转染组,转染72h后,除外正常对照组(只加无血清培养基)加入含有ox-LDL(终浓度为150μg/ml)的无血清培养基。培养24h后,采用MTT比色法检测细胞存活率及增殖情况,流式细胞仪检测细胞凋亡,Western Blotting检测各组细胞凋亡基因Bcl-2/Bax的表达情况。 结果 1、测序证实,靶向LOX-1RNAi慢病毒载体构建成功,测定病毒滴度为(4-6)×108TU/ml。 2、转染预实验通过观察绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein, GFP)表达及细胞生长状态得出：MOI=20且在终浓度为5μg/mlPolybrene的条件下细胞转染96h转染效率达到90%以上且细胞生长状态佳,并且GFP持续稳定表达。 3. RT-PCR和Western Blotting结果分别从mRNA和蛋白水平显示LOX-1的表达在CON组与LV-NC组之间不具有统计学差异,病毒阳性转染组与CON组和LV-NC组之间具有统计学差异(P0.05),其表达皆有不同程度的抑制,其中以I_V-OLR1-RNAi-3组的抑制率最高。 4、MTT检测结果显示给予ox-LDL处理后,未干预LOX-1表达组的细胞存活率较正常对照组明显降低,细胞增殖减少,差异有统计学意义(P0.05)；而给予LV-OLR1-RNAi转染预处理的细胞再进行ox-LDL处理后,细胞存活率较未干预LOX-1表达组明显升高,细胞增殖增加,差异有统计学意义(P0.05)；流式细胞仪检测结果亦显示给予LV-OLR1-RNAi转染预处理的细胞ox-LDL诱导的细胞凋亡率明显小于未干预LOX-1表达组(P0.05)。 5、Western Blotting测定凋亡蛋白结果显示单纯给予ox-LDL处理后Bcl-2表达降低,Bax表达升高,Bcl-2/Bax比例减小,差异有统计学意义(P0.05)；而抑制LOX-1表达后再给予ox-LDL处理,则Bcl-2表达升高,Bax表达降低,Bcl-2/Bax比例增加,差异有统计学意义(P0.05)。 结论 1、本研究运用RNAi技术成功构建靶向LOX-1RNAi慢病毒载体,并有效抑制LOX-1表达。 2、干扰LOX-1表达后,可减少ox-LDL诱导HUVECs的凋亡率,增加其存活率,并通过增加Bcl-2表达,抑制Bax表达,提高Bcl-2/Bax比例来抑制。x-LDL诱导的内皮细胞凋亡,起到抗动脉粥样硬化的作用。
【学位授予单位】：辽宁医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R373

【参考文献】

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1 王春霞;;RNA干扰技术在临床中的应用[J];临床医学;2009年09期

2 万春鹏;周寿然;左爱仁;;RNA干扰机制及其应用研究进展[J];现代生物医学进展;2008年02期

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本文编号：1288982