人C型凝集素受体Dectin-1新亚型的功能研究

发布时间：2017-12-20 12:11

  本文关键词：人C型凝集素受体Dectin-1新亚型的功能研究　出处：《第二军医大学》2014年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：白念珠菌（Candida albicans）是一种常见的条件致病菌，当机体免疫力下降时，白念珠菌会侵入机体引发多种疾病，从轻度的皮肤黏膜感染到重症的系统性真菌感染。尽管现代医药技术不断发展，但是有白念珠菌引发的感染率和死亡率依然很高。这就需要我们对于白念珠菌的致病性和机体对其的免疫反应要有更深入的理解。白念珠菌是双形态菌通常以酵母态粘附在人体的组织粘膜上,当白念珠菌感染时，巨噬细胞和树突状细胞通过模式识别受体识别真菌细胞壁上的模式识别分子，触发一系列的胞内信号级联反应，导致许多转录因子的激活，从而进一步诱导多种细胞因子和趋化因子的表达，引发炎症反应。 固有免疫细胞表面的模式识别受体既可以识别白念珠菌表面的甘露聚糖和甘露糖蛋白，也可以识别白念珠菌出芽分裂是暴露的内层的β-葡聚糖和几丁质。目前为止，识别这些不同病原相关模式分子的模式识别受体主要可以分为以下几类：Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs），C型凝集素受体（C-type lectinreceptors，CLRs), NOD (nucleotide-binding domain leucine-rich repeat-containingreceptors，NLRs)样受体和RIG（retinoic acid-inducible gene-I receptors,RLRs)样受体。其中C型凝集素受体在抗真菌免疫中发挥着重要的作用。C型凝集素受体是由一类含有C型凝集素结构域的蛋白组成的超家族。它可以识别大多数的致病真菌，其主要配体分子为真菌细胞壁表面的甘露糖和β-葡聚糖。 Dectin-1是研究最为全面的C型凝集素受体，它主要识别真菌细胞壁上的β-葡聚糖。Dectin-1可以介导吞噬细胞对白念珠菌的吞噬，并通过介导免疫细胞产生活性氧来直接杀伤真菌。Dectin-1是II跨膜蛋白，由胞外段的糖结合区域CRD结构，跨膜段和胞内的免疫受体络氨酸活化基序（immunoreceptor tyrosineactivation motif, ITAM）组成。Dectin-1被激活后，可以通过胞内的ITAM基序来募集激活Syk激酶，诱导CARD9/Bcl10/MALT1形成复合体，进而激活NF-κB,另外也可激活MAPKs和NFAT。 人的Dectin-1基因通过转录后的可变剪贴产生了8个亚型，两个主要亚型（A,B）和6个次要亚型（C，D，E，F，G，H）。在这8个亚型中只有三个亚型（A，B，，E,）同时具有完整的CRD结构域和ITAM基序。前期的研究表明Dectin-1的A，B两个亚型是主要的功能亚型，本课题对Dectin-1的E亚型进行研究，探讨其功能活性。 在第一部分的研究中我们利用RT-PCR技术从人的外周血中克隆得到了Dectin-1E亚型的基因序列。将Dectin-1E亚型克隆到慢病毒载体pRV3中，连同组成性质粒一同转染293FT细胞中包装病毒，用包装好的病毒转染RAW264.7细胞，获得表达Dectin-1E亚型的RAW264.7-Dectin-1E细胞。我们用白念珠菌酵母态刺激RAW264.7-Dectin-1E细胞发现可以引起胞内NF-κB通路关键分子IκB的磷酸化，最终激活NF-κB导致NF-κB p65亚单位入核增加。说明Dectin-1E亚型可以介导白念珠菌刺激引起的胞内信号通路的激活，我们首次明确了Dectin-1E亚型为功能亚型，可以识别被吞进胞内的白念珠菌。 在第二部分我们用原核表达获得的人Dectin-1胞外段作为抗原免疫小鼠来制备Dectin-1的抗体。利用PCR技术克隆获得Dectin-1胞外段序列，并构pET-28a-Dectin-1胞外段和His的融合质粒，转化受体菌E．coli BL21，经IPTG诱导表达融合蛋白，采用His亲和纯化方法，纯化融合蛋白。将融合蛋白免疫小鼠，制备Dectin-1单克隆抗体，经过筛选我们获得4株杂交瘤细胞可以分泌抗体与Dectin-1E亚型结合。 简而言之，我们的研究发现了一个新的Dectin-1亚型可以介导白念珠菌酵母态刺激引发的信号传导，并制备了Dectin-1的小鼠单克隆抗体。
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R379.4

【共引文献】

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本文编号：1312038