肺、体血管平滑肌细胞线粒体的异质性

发布时间：2017-12-27 17:25

本文关键词：肺、体血管平滑肌细胞线粒体的异质性　出处：《华中科技大学》2010年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:对比提取肺动脉、股动脉、股静脉平滑肌细胞(PASMC、FASMC、FVSMC)线粒体方法的成功率差异。方法:断颈法处死150g左右的SD雄性大鼠,分离肺动脉、股动脉、股静脉血管放置于冰浴的D-Hank’s液中,在显微镜下去除血管外膜内膜,获得平滑肌层。平滑肌层放入缓冲液中匀浆,匀浆后加入蛋白酶抑制剂cocktail。匀浆液放入EP管,4℃600g离心5min,取上清置于另一EP管内,4℃5000g离心10min,所获沉淀即为线粒体。方法改动:梯度离心时两次离心力改为1000g,10min/10000g,15min;600g,5min/7000g,10min两种搭配。结果:在三种离心速度搭配的改动中,线粒体提取成功率有显著提高。离心力搭配为600g,5min/5000g,10min时,成功率为47.4%;离心力搭配为1000g,10min/10000g,15min时,成功率为50%;离心力搭配为600g,5min/7000g,10min时,成功率为89.8%。结论:当离心力搭配为600g,5min/7000g,10min时,提取线粒体的成功率最高。目的:1.提取线粒体后对比PASMC、FASMC、FVSMC中线粒体数量的差异。2.用ELISA测定柠檬酸合成酶(CS)含量间接反应线粒体含量。3.通过对比三种平滑肌细胞中线粒体琥珀酸脱氢酶(SDH)的活性差异,间接反映三种平滑肌细胞中线粒体活性的差异。方法:1.线粒体的提取:断颈法处死150g的SD雄鼠,取出肺动脉、股动脉、股静脉,放置于冰浴的D-Hank’s液中,在显微镜下去除血管外膜、内膜,获得平滑肌层。平滑肌层放入缓冲液中匀浆,匀浆后加入蛋白酶抑制剂,之后匀浆液放入EP管4℃600g离心5min,取出上清液放入新的EP管,4℃7000g离心10min,所获沉淀即为平滑肌层线粒体。2.线粒体计数:线粒体重悬于100μL配好的Mito-track-green染料中,放置在37℃孵育30min,染色结束后,4℃7000g离心10min,弃去上清,沉淀重悬于匀浆缓冲液,震荡混匀后4℃7000g离心15min,即获得被Mito-track-green着染的纯化线粒体。取获得的已染色的线粒体悬液10μL加入细胞计数板,在荧光显微镜下观察并计数数荧光亮点,之后通过细胞计数板计数得出线粒体悬液浓度。3.蛋白浓度测定:取第一次离心后所得的上清液40μL测定蛋白含量。线粒体数/蛋白质量=单位质量蛋白所含的线粒体数。4.柠檬酸合成酶含量的测定:取1步骤中第一次离心后的上清1mL,分为五份,-20℃保存,按ELISA试剂盒说明书测柠檬酸合成酶含量。5.琥珀酸脱氢酶活性测定:将提取的线粒体重悬于100μL组织裂解液,4℃冰浴中裂解1小时,之后4℃120000r/min离心5min。取40μL上清液测蛋白浓度,50μL上清液测SDH活性。活性测定方法按照试剂盒说明书操作。结果:1.线粒体计数结果:PASMC中线粒体数为2×106个/mg pro(n=5),FASMC中线粒体数为3.5×106个/mg pro(n=5),FVSMC中线粒体数为5.6×106个/mg pro(n=5);三种血管平滑肌细胞线粒体数量存在显著性差异(p0.05)。 2.柠檬酸合成酶含量测定结果:(1)PASMC中CS含量为4.43ng/mg pro、FASMC中CS含量为8.46ng/mg pro,FVSMC中CS含量为7.23ng/mg pro。PASMC与FASMC两者间的差异有统计学意义(n=3,p0.05);(2)PASMC中单个线粒体CS含量为1.99×10-3pg、FASMC中单个线粒体CS含量为1.27×10-3pg、FVSMC中单个线粒体CS含量为2.40×10-3pg,FASMC与FVSMC两者间有差异(n=3,p0.05)。 3.琥珀酸脱氢酶活性检测结果:FASMC与FVSMC中SDH活性比PASMC中SDH活性高,FASMC中SDH活性是PASMC中SDH活性的210.36%(n=6,p0.05);FVSMC中SDH活性是PASMC中SDH活性的243.45%(n=9,p0.05)。结论:1.股静脉血管平滑肌中线粒体数量最多,股动脉其次,肺动脉最少。2. PASMC中CS含量最低,FASMC中CS含量最高;就单个线粒体而言,FVSMC中CS含量最低,FASMC中CS含量最高。3. FASMC和FVSMC中SDH活性均比PASMC中的SDH活性高,FVSMC中SDH活性最高。
[Abstract]:Objective: To compare the differences in the success rate of mitochondrial methods for extracting pulmonary, femoral and venous smooth muscle cells (PASMC, FASMC, FVSMC).
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R363

【参考文献】