去分化来源表皮干细胞的诱导及应用研究

发布时间：2017-12-27 22:33

  本文关键词：去分化来源表皮干细胞的诱导及应用研究　出处：《中国人民解放军军医进修学院》2009年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】： 目的:1.通过建立表皮细胞去分化的三种体外模型,对比三种去分化来源的表皮干细胞(dedifferention epidermal stem cells,DESCs)和原始表皮干细胞(epidermal stem cells,ESCs)的细胞形态和免疫表型,从中筛选出高效率的去分化诱导方法;2.将DESCs移植入裸鼠(BALB/c mice)背部创面,观察其对创面愈合的促进作用。 方法:1.由人新鲜的包皮标本中分离获得ESCs,通过传代培养获得成熟的表皮细胞(epidermal cells,ECs),倒置显微镜下观察两种细胞的形态、免疫组化检测细胞表型、流式细胞仪检测细胞周期及增殖指数。2.取同一包皮分离的ESCs,随机均分为5组,将其中一组ESCs作为原始表皮干细胞进行冻存待检测,其余4组进行培养传代,获得成熟的ECs。再分别以热、双氧水(H_2O_2)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)处理其中的3组ECs,并在处理后3d、7d、14d将3组去分化细胞与ESCs和ECs两对照组一起进行相关检测:以倒置相差显微镜观察细胞形态改变;细胞免疫组织化学观察β1整合素、CK10、CK19等表型的变化;随机选10个视野做β1整合素阳性细胞计数、统计学分析。3.建立裸鼠背部创面模型,麻醉下在每个裸鼠背部脊柱两侧制备2个直径为6mm的圆形创面,直至深筋膜,共24个创面。将24个创面随机分为DESCs、ESCs、ECs、生理盐水(normal saline,NS)组等4组,每组6个创面。分别消化离心以DAPI标记的DESCs、ESCs、ECs,加入适量NS使细胞悬液终浓度都为2×10~6个/ml。用1ml注射器分别将DESCs、ESCs、ECs和NS注射于相应创缘皮下及创面基底部,剂量为每个创面0.2ml。于术后0d、3d、7d统计创面面积进行统计学分析;在术后7d进行创面取材制片,荧光显微镜观察标记DAPI的DESCs、ESCs、ECs在创面的分布情况;创面取材制片行HE染色对比创面的愈合情况。 结果:1.新鲜分离的ESCs小圆珠状,核大,核浆比高,细胞贴壁生长后连接成片成铺路石样,免疫组化显示其β1整合素、CK19表达呈阳性,CK10表达阴性;ECs则宽大扁平,形态不规则,核小,核浆比低,无法形成克隆,其CK10表达呈阳性,β1整合素、CK19表达阴性。ESCs处于增殖期(G2/M)的细胞比例要高于ECs。2.三种DESCs在3d、7d、14d的β1整合素阳性细胞数均高于ECs组(p＜0.01);应用bFGF处理获得的DESCs在3d和7d的β1整合素阳性细胞数要高于其它两种处理组(p＜0.01);三种DESCs在14d时的β1整合素阳性细胞数无明显差异(p＞0.05),和原始ESCs相比亦无明显差异(p＞0.05)。3.创面愈合实验中DESCs组和ESCs组在术后3d和7d的创面面积均小于ECs组和NS组(p＜0.01),DESCs组和ESCs组在术后3d和7d的创面面积则无明显差异(p＞0.05)。荧光显微镜检查发现术后7d用DAPI标记的DESCs和ESCs在皮肤和皮下组织内皆有分布,说明两种ESCs均参与了创面修复;未发现DAPI标记的ECs参与创面修复。HE染色切片显示DESCs组和ESCs组的创面愈合质量要高于两个对照组,其皮下的纤维组织较少,并发现有皮肤附属腺的再生。 结论:热、H_2O_2和bFGF皆可诱导ECs去分化成ESCs,其中bFGF比热和H_2O_2在处理后3d和7d具有更高的促使ECs去分化效率;DESCs和ESCs都可促进创面修复,两者之间无明显差异。
[Abstract]:Objective: three to 1. through the establishment of in vitro differentiation of epidermal cells, comparing the three kinds of dedifferentiation derived epithelial stem cells (dedifferention epidermal stem cells, DESCs) and the original epidermal stem cells (epidermal stem cells, ESCs) cell morphology and immunophenotype, screened from high efficiency to differentiation method; 2. DESCs will be transplanted into nude mice (BALB/c mice) wound, observe its effects on wound healing.
【学位授予单位】：中国人民解放军军医进修学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R329

【参考文献】

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本文编号：1343495