培养人羊膜间充质干细胞构建组织工程角膜上皮层的实验研究

发布时间：2017-12-27 23:18

  本文关键词：培养人羊膜间充质干细胞构建组织工程角膜上皮层的实验研究　出处：《暨南大学》2010年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】： 目的：1、比较不同消化分离方法提取人羊膜间充质干细胞(HAMSCs)的分离效果,以选择一种更有效的分离方法。2、探索水溶性量子点(QDs)活体示踪标记HAMSCs的最适条件,以便能较好地应用于后期活体示踪标记HAMSCs体内诱导分化的实验。3、探讨HAMSCs构建组织工程角膜上皮层的可能性。 方法：1、将新鲜羊膜组织分成4片6cm×6cm大小的组织块,采用4种不同方法进行消化分离：第一组：先刮除+胶原酶Ⅱ组；第二组：先刮除+胶原酶Ⅳ组；第三组：先剪碎+胶原酶Ⅱ组；第四组：先剪碎+胶原酶Ⅳ组。对这4组原代培养HAMSCs进行存活数,形态学观察比较,第3代HAMSCs抗原检测及成脂成骨诱导分化实验。2、将10nmol/L浓度的水溶性CdSe/ZnS QDs与第3代HAMSCs分别标记20min、30min、40min、60min,激光共聚焦扫描显微镜观察哪个标记时间HAMSCs获取的QDs量最多并且比较常规培养14d后各标记时间的QDs存留于HAMSCs体内的情况。3、将第3代HAMSCs种植于去角膜上皮细胞的兔角膜基质片上进行培养,待HAMSCs达到80%-90%融合时,再移至插入式培养皿中进行气液界面诱导分化培养14d,最后将兔角膜基质片进行固定、切片、HE染色和CK3+12免疫组化检测。 结果：1、第一组和第二组的HAMSCs存活数高于第三组和第四组(p0.05)。第一组和第二组的HAMSCs成份较第三组和第四组纯净,后两组夹杂着一些团状的人羊膜上皮细胞(HAECs)。抗原结果显示CD29、CD44、CD73、CD90、CD105表达阳性,CD31、CD34、CD45、HLA-DR表达阴性,Vimentin、SSEA-3、SSEA-4、OCT-4、telomerase结果阳性。成脂成骨诱导分化实验成功。2、lOnmol/L QDs标记30min和40min后,HAMSCs获取的QDs和常规培养14d后存留于HAMSCs体内的QDs都是最多的。3、HAMSCs在去角膜上皮细胞的兔角膜基质片上气液界面共培养14d后可形成3-5层的复层细胞,实验组CK3+12免疫组化检测呈阳性。 结论：1、通过先将人羊膜用胰蛋白酶+EDTA消化液消化后,再将HAECs刮除干净,然后剪碎再用胶原酶消化的改进方法是对HAMSCs保护较好,较易提取,获取细胞量和纯度均较传统方法高。胶原酶Ⅱ和胶原酶Ⅳ两种消化酶对HAMSCs的提取影响不大。2、10nmol/L浓度的QDs和30min或40min的标记时间是用于HAMSCs活细胞成像和动态研究及体内示踪的一个较好的标记条件。3、HAMSCs可能成为眼表疾病患者重构角膜上皮层和恢复视觉功能的一种更方便、更理想的种子细胞。
[Abstract]:Objective: 1. The isolation of human amniotic mesenchymal stem cells (HAMSCs) was extracted by different digestion methods, so as to choose a more effective separation method. 2, explore the best conditions of labeling HAMSCs with living water tracer quantum dots (QDs) in vivo, so that it can be well applied to late vivo labeling of HAMSCs induced differentiation in vivo. 3. The possibility of constructing the corneal epithelial layer of tissue engineering by HAMSCs was discussed.
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R329

【参考文献】

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本文编号：1343612