人胚胎干细胞的优化培养以及向神经干细胞的分化研究

发布时间：2017-12-28 22:33

本文关键词：人胚胎干细胞的优化培养以及向神经干细胞的分化研究　出处：《华中科技大学》2009年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 本实验分三部分解决两株中国人胚胎干细胞优化培养的问题，并将纯化的干细胞高效诱导为神经干细胞。在实验过程中对相关实验条件和技术问题进行探索。第一部分人胚胎干细胞在永生化人成体成纤维细胞饲养层上的培养目的用永生化的人成体成纤维细胞(HAFi)作为饲养层取代小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)培养两株中国人胚胎干细胞(hESC)，去除动物源性的细胞混杂。方法用不同密度的HAFi制备饲养层，，将两株人胚胎干细胞种植其上。观察细胞生长情况并绘制HAFi和在此饲养层上的hESC的生长曲线。比较0．05％的胰蛋白酶、1mg／mLⅣ型胶原酶和机械法传代三种传代方式对细胞培养的影响。所得干细胞进行基本性质的鉴定，并通过流式细胞术检测未分化率，MEF为饲养层的培养方式作为对照。结果1．HAFi细胞饲养层上两株中国人胚胎干细胞的生长在形态学上与在MEF上的干细胞类似。经过鉴定保持了人胚胎干细胞的基本性质：AKP染色阳性，未分化标记TRA-1-60、TRA-1-81检测均为强阳性，OCT-4表达阳性，核型正常。 2．hESC在HAFi饲养层的未分化率与MEF饲养层接近，流式细胞检测未分化SSEA-4阳性细胞分别为90．467％±0．907和92．1％±0．82，细胞增殖速度也类似，均7天传代一次。 3．HAFi细胞饲养层的密度对两株中国人胚胎干细胞的生长和分化率有较大影响。6×10~5／mL的细胞密度为最佳密度，可以保持干细胞较低的分化率和较高的增殖速度。所用密度高于国外报道。 4．Ⅳ型胶原酶法传代是两株人胚胎干细胞在HAFi饲养层传代的最佳方式。操作简单、污染几率小、对细胞的生长影响也较低，不足之处在于会携带部分饲养层细胞同时传代。结论HAFi细胞可以用做两株中国人胚胎干细胞培养的饲养层，取代MEF后解决了动物源性细胞混杂和异源污染问题，省却了饲养层原代细胞的培养步骤同时解决了由不同批次饲养层差异带来的培养体系的不稳定。本实验还初步提示了两株中国人胚胎干细胞与欧美国家建系的干细胞有所不同。第二部分人胚胎干细胞无饲养层培养体系的建立与鉴定目的建立两株中国人胚胎干细胞无饲养层的培养体系，从根本上纯化干细胞。方法用基质胶(Matrigel)作为细胞外基质。分别使用MEF和HAFi饲养层上清获得的条件培养基(MEF-CM，HAFi-CM)，添加TGFβ_1、Noggin和不同浓度bFGF的单因子非条件培养基以及FT、FTN、FTNI、TNI等多因子联合非条件培养基进行培养。观察细胞在不同无饲养层体系的生长情况，用流式细胞术检测细胞分化率，统计细胞传代周期，从而对不同的无饲养层体系和因子作用做出评估；比较不同MEF饲养层密度获得的MEF-CM以及不同的传代方法对干细胞生长的影响；对所得干细胞进行基本性质的鉴定。结果1．两株中国人胚胎干细胞可以在MEF-CM、FM160、FM250以及FT、FTN、FTNI等多因子联合培养基与基质胶共同构建的无饲养层培养体系中生长。 2．6×10~5／mL—12×10~5／mL的MEF饲养层密度适合获取MEF-CM。 3．机械法传代可以用于hESC从饲养层到无饲养层的转移步骤，Ⅳ型胶酶法传代可以用于无饲养层的长期传代。 4．流式细胞检测未分化率MEF-CM＞FTNI≈FTN＞FT＞FM160≈FM250＞TNI 5．传代周期TNI＞FTN＞FT＞FM160≈FTNI＞FM250＞MEF-CM 6．经过鉴定两株中国人胚胎干细胞在无饲养层培养体系中保持了人胚胎干细胞的基本性质。结论：通过本部分实验，我们成功建立了两株中国人胚胎干细胞的无饲养层培养体系。FTNI是我们发现的适合于两株中国人胚胎干细胞的最佳非条件培养基因子组合，国外也尚未见同样的因子组合的报道。无饲养层培养体系的建立为纯化细胞提供了可行的方法并为下一步实验室和临床应用打下了基础。第三部分纯化的人胚胎干细胞向神经干细胞的诱导分化目的探寻用纯化的人胚胎干细胞向神经干细胞分化的最佳诱导方法。方法用两种不同的方法：经拟胚体途径诱导和直接诱导法进行干细胞诱导。经拟胚体途径诱导法：先获得大量的拟胚体，拟胚体打散贴壁后用诱导培养基进行诱导，消化后悬浮扩增培养。直接诱导法：纯化的干细胞消化成合适的细胞团块，用神经干细胞诱导培养基悬浮培养5-6天，然后使细胞团贴壁继续培养16-20天，0．05％胰蛋白酶消化成细胞团后神经干细胞扩增培养基重新悬浮扩增培养。结果1用纯化的hESC可以简单高效的获得大量拟胚体 2经拟胚体诱导途径获得的神经干细胞，流式细胞检测nestin阳性细胞比例为：51．7％±1．70；直接诱导法获得的神经干细胞，流式细胞检测nestin阳性细胞比例为88．83％±3．40；两种方法所得神经干细胞均可分化成GFAP或MAP2阳性的各种成熟神经细胞。结论经拟胚体诱导途径的诱导方法是相对廉价的诱导方法，但在技术上还需进一步突破。以NeuroBasal Medium为基础培养基添加bFGF、noggin、B27、N2、ITS+1等与基质胶联合构成的诱导体系耗时短、效率高，可以作为一种高效诱导体系推广。
[Abstract]:The experiment is divided into three parts to solve the problem of optimizing the culture of two Chinese human embryonic stem cells, and the purified stem cells are efficiently induced into neural stem cells. In the process of experiment, the relevant experimental conditions and technical problems are explored.
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R329

【参考文献】