基于EHECO157:H7志贺毒素ⅡB细胞表位肽的中和性MAb制备与生物学鉴定

发布时间：2017-12-30 08:01

本文关键词：基于EHECO157:H7志贺毒素ⅡB细胞表位肽的中和性MAb制备与生物学鉴定　出处：《第三军医大学》2008年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 肠出血性大肠杆菌(EHEC) O157:H7为重要的新发人畜共患传染病原,1982年被确认为致病菌以来的20多年中,其引发的食物中毒在世界各地包括中国均有大规模的暴发流行。该菌的感染已经成为一个全球性的公共卫生问题,无论在发达国家还是发展中国家,都受到广泛关注。由于EHEC O157:H7菌培养容易、感染力强、传播途径多样,因此,O157菌极有可能当作为未来战争军事斗争的细菌武器和生物恐怖的战剂。然而目前对其感染尚缺乏有效的防治方法。研究证明:抗生素可促使O157菌释放致死性志贺毒素(Shiga toxin, Stx),从而使患者并发HUS的危险性增加。研究表明:Stx2是O157:H7的主要致病因子。Stx可以进入血液循环,引起靶组织器官损伤,导致溶血性尿毒综合征(HUS)及血栓性血小板减少紫癜(TTP)等严重并发症的发生。Stx分为Stx1和Stx2,用纯化的Stx1和Stx2处理人肾脏微血管内皮细胞,结果显示:Stx2比Stx1的毒性大1000倍。Stx2是引起儿童和老年人发生HUS的主要毒素,造成该人群的死亡率高达50%。因此,Stx2是目前O157:H7感染治疗药物研究的主要靶标。 Stx2蛋白质由1个A亚基(32KDa)和5个B亚基(7.7KDa/单体)组成。A亚单位包括A1和A2两个片段。A1片段为毒性活性片段,A2片段插入5个B亚基形成的孔中,B亚基为Stx2与细胞受体结合部位。Stx2通过B亚基与受体Gb3结合后,进入细胞,在弗林蛋白酶(一种钙敏感的丝氨酸蛋白酶)作用下A亚基被裂解为A1和A2两个片段,A1片断经内质网进入细胞质暴露毒性活性位点 A1片段发挥N-糖苷酶活性,导致真核细胞蛋白质合成的终止,最终导致细胞的死亡。鉴于Stx2的结构和致病机理,针对Stx2的药物研究主要集中在三个方面:STX2中和性抗体、Stx2疫苗Stx2特异受体Gb3的类事物,相比之下,Stx2中和性抗体在O157:H7感染的紧急治疗中更显优势。因此,基于以上认识,本课题将以EHEC O157:H7 Stx2的晶体结构为基础,辅以DNAStar软件分析,预测并筛选靶向Stx2 A1片段毒性活性中心的保护性B细胞表位肽,利用此肽制备靶向Stx2毒性活性中心的中和性单克隆抗体,在此基础上制备Fab基因工程抗体,以期获得具有临床治疗价值的中和性抗体。本研究主要分四个部分: 第一部分基于EHEC O157:H7 Stx2晶体结构的B细胞表位肽的预测与免疫原性鉴定 Stx2保护性B细胞表位肽的预测与鉴定是利用保护性B细胞表位肽为抗原靶向性制备Stx2中和性抗体的第一步。本部分研究是首先在NCBI的结构数据库检索EHEC O157:H7的Stx2以及Stx2与配体腺嘌呤复合物晶体结构解析图(编号1R4P和2GA4)。基于Stx2与配体腺嘌呤相互作用的立体结构,依据B表位肽的预测原则,选取Stx2 A1毒性片段上的4条氨基酸肽段,采用DNAStar软件对预测的4条氨基酸肽段进行亲水性(Kyte-Doolittle方案)、表面可及性(Emini方案)、可塑性(Karp lus-Schulz方案)、二级结构(Garnier和Chou-Fasman方案)及抗原性(Jameson-Wolf方案)等参数进行评价,通过BLAST检索比较被预选B细胞表位肽与人、兔、鼠的同源性后,最终确定本研究所用的4条可能的B表位多肽序列,分别为P1(53aa~80aa)、P2(162aa~88aa)、P3(28aa~49aa)、P4(100aa~114aa);人工合成4条B表位肽(由北京中科亚光公司协助合成),并且均偶联载体蛋白钥孔戚血蓝素(keyhole limpet hemocyanin KLH)后分别免疫日本大耳兔,鉴定其免疫原性,间接ELISA结果显示:4条合成多肽均能刺激日本大耳兔产生抗多肽和天然Stx2的抗体,抗血清与天然Stx2反应的效价P2P1P3P4;Dot ELISA结果显示:4条B细胞表位肽制备的兔多克隆抗体能特异的与B细胞表位肽、Stx2和载体蛋白KLH反应;Western blot结果显示:4条B细胞表位肽诱导机体产生特异针对Stx2 A亚单位的多克隆抗体,以上结果表明预测的4条多肽具有免疫原性,能刺激机体产生特异的抗Stx2A亚单位的抗体,确为B细胞表位肽。用4条B细胞表位肽免疫Balb/c小鼠后,以天然Stx2攻毒,筛选出的P1(53aa~80aa)多肽为保护性B细胞表位肽,该表位肽包括Stx2毒性活性位点即位于Stx2 A1片段的第77位氨基酸-酪氨酸,为靶向Stx2毒素活性中心的中和性单克隆抗体的研制奠定了基础。第二部分基于EHEC O157:H7 Stx2 B细胞表位肽的中和性MAb制备与生物学鉴定目前临床上尚无特异的抗Stx2的治疗性药物,研究具有中和活性的单克隆抗体对EHEC O157:H7菌感染后的紧急治疗具有意义。本部分研究是在第一部分成功获得包含Stx2毒性活性中心的P1(53aa~80aa)保护性B细胞表位肽的基础上,靶向性制备抗Stx2中和性单克隆抗体,并对单抗的生物学活性进行了鉴定。首先,以偶联载体蛋白KLH的P1保护性B细胞表位肽为免疫原,在应用传统的杂交瘤技术的基础上,采用含HAT的甲基纤维素半固体培养基和以天然Stx2为筛选抗原的间接ELISA方法,快速筛选针对Stx2的单克隆杂交瘤细胞株。结果从1700个单克隆杂交瘤细胞中筛选出7株稳定分泌抗天然Stx2的单克隆杂交瘤细胞株,染色体核型鉴定结果显示:1F2、18C3、1G1和6B3 4株杂交瘤细胞的染色体数目分别为106、100、98和104,接近小鼠脾细胞(2n=40)与Sp2/0骨髓瘤细胞(2n=62~68)染色体数目的总和,说明1F2、18C3、1G1和6B3 4株杂交瘤细胞为小鼠脾细胞与Sp2/0细胞的融合体。而9D7、8D4和11D3的染色体数目分别140、144和142,比小鼠脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞染色体数目的总和约多40条,与2个脾细胞与1个SP2/0细胞的三倍体杂交瘤细胞的染色体数目相似;Dot-ELISA和Western Blot鉴定结果显示:1F2、18C3、1G1、6B3 4株单抗为Stx2 A亚单位特异的单克隆抗体,而8D4、11D3、9D7 3株单抗与KLH有交叉反应,结合3株杂交瘤细胞的染色体数目为三倍体的结果,推测其原因可能是一个单克隆细胞株融合了针对Stx2和KLH两种抗原决定簇的B淋巴细胞染色体;单克隆抗体的亚类鉴定结果显示:1F2、3B6、1G1和18C3 4株天然Stx2特异的单克隆抗体均属于IgG1κ型;1F2、3B6、1G1和18C3 4株单抗的抗体亲和力常数鉴定结果分别为1.7×10-9、6.3×10-8、5.7×10-7和9×10-7。体外细胞毒阻断试验表明1F2、18C3、1G1和6B3 4株单克隆均有中和Stx2的作用,4株单抗中和作用相比:1F218C31G1=6B3;同时高剂量的单抗具有明显的预防保护作用;体外单克隆抗体治疗保护试验研究显示:1F2和18C3的高剂量组有一定的治疗保护作用,而且加入抗体越早中和作用越明显,一旦毒素与细胞结合则抗体不能发挥保护作用,同时结果显示1G1和6B3没有明显的治疗保护作用,其原因可能与2株抗体的亲和力较低有关。此外,P1B细胞表位肽体外竞争抑制1F2单克隆抗体对Stx2毒性中和作用试验结果表明:P1B细胞表位肽与Stx2具有相同的毒性活性表位,因此本研究选用体外实验证明预防保护作用最强的1F2单抗作为动物体内保护作用研究的对象。1F2单克隆抗体体内预防保护实验结果显示:高剂量的1F2单克隆抗体组(3200ng/kg)的小鼠较存活率为80%(8/10),明显比中、低剂量1F2单克隆抗体对Stx2的预防保护作用强;1F2单克隆抗体体内治疗保护实验结果显示:高剂量的1F2单克隆抗体组的小鼠存活率达60%(6/10),具有明显的治疗效果,而中低剂量的1F2单克隆抗体对预先用Stx2攻毒的小鼠的治疗效果较弱,为20%(2/10)~10% (1/10)。本部分研究表明:制备的抗Stx2毒性活性中心的单克隆抗体1F2具有高特异性、高亲和力,在动物体内能有效中和Stx2毒素,具有良好预防和治疗作用。为临床上使用抗Stx2的特异性抗体治疗EHEC O157:H7感染,预防HUS和TTP等并发症的出现,提供了可能。本研究制备的抗Stx2毒性活性中心的单克隆抗体1F2可用于基因工程改造,制备各种形式的重组抗体。第三部分EHEC O157:H7 Stx2中和性Fab抗体的构建及基因结构分析鼠源性单克隆抗体的异源性,限制了其在临床治疗中的应用,本部分研究采用基因工程技术将1F2中和性单抗改造成Fab基因工程抗体。首先从分泌抗Stx2毒性活性中心的中和性单克隆抗体杂交瘤细胞株1F2中提取总RNA,以提取的总RNA为模板,采用One step PT-PCR试剂盒,以根据鼠免疫球蛋白不同家族的可变区基因序列设计的7对κ轻链引物和8对IgG1重链Fd片段引物,分别扩增1F2抗体的κ轻链和Fd片段基因,将钓取的抗体κ链和Fd链基因构建至Fab抗体表达载体Pcomb3X,并切除Pcomb3X载体上的噬菌体外壳蛋白Ⅲ的基因后,转化XL-Blue菌。本部分研究成功构建了1F2Fab抗体的表达载体,基因测序结果显示:1F2Fab抗体的κ链为648bp,Fd1链为636bp,采用生物信息学方法对所得Fab抗体序列与现有已报道的其它各种抗体基因进行同源性比较,分析其胚系基因来源,结果κ链基因序列与鼠抗体的κ链的胚系基因以及Fd链基因序列和鼠抗体重链的胚系基因具有较高的一致性,分别为92%和87%,且和现有报道的各种其它已知抗体基因序列均不完全一致。说明1F2Fab抗体的基因的确来自小鼠胚系基因。根据1F2Fab抗体基因序列,经计算机软件推导出编码1F2Fab抗体的Fd链编码212个氨基酸,分子量为22436.31Da;1F2Fab抗体的κ编码216个氨基酸,分子量为23882.52Da。将1F2Fab抗体的氨基酸序列提交SWISS-MODEL在线工具,经分子模建对其三级结构进行预测并提交PDB数据库比对,结果显示:1F2Fab抗体的Fd链具有鼠Fab抗体重链结构特征,可变区位于1~108位氨基酸;1F2Fab抗体的κ链具有鼠Fab抗体轻链结构特征,可变区位于1~106位氨基酸。Fd链的CDR1、CDR2和CDR3的区域分别为20aa~27aa、45aa~52aa和91a~100aa;κ链的CDR1、CDR2和CDR3的区域分别为24aa~34aa,52aa~54aa和91aa~98aa。Fd链氨基酸序列的第16、90、137、192、212位氨基酸和κ链氨基酸序列的第21、91、137、197、216位氨基酸均为半胱氨酸,可以形成链内和链间二硫键。基因结构分析结果为阐明抗1F2Fab抗体基因的结构特性及进一步通过基因改造提高抗体的应用价值打下了基础。第四部分EHEC O157:H7 Stx2中和性Fab抗体的可溶表达及生物学功能研究本研究将Pcomb3X-1F2Fab重组质粒转化XL-blue工程菌,30℃下经IPTG诱导14h,收集诱导后重组工程菌超声破菌上清。间接ELISA检测重组工程菌超声破菌上清,出现阳性结果;SDS-PAGE检测显示:在Mr约为23KDa处出现1条新的蛋白表达带,与1F2Fabκ链和Fd链预测的分子量相近,说明重组子Pcomb3-1F2Fab/XL-blue在IPTG的诱导下能分泌性表达具有与天然Stx2特异结合的1F2Fab抗体,但凝胶成像分析系统扫描分析结果显示1F2Fab抗体的表达量低,约为2%。采用Protein L Resin抗体亲和层析柱纯化1F2Fab抗体,纯化后样品经SDS-PAGE后,采用凝胶成像分析系统扫描分析蛋白纯度为95%。Western blot结果表明,纯化后的1F2Fab抗体能与相应转移至硝酸纤维素膜上的天然Stx2 A亚单位蛋白在32KDa处形成单一的蛋白质染色带;竞争ELISA检测结果表明,1F2Fab抗体能与亲本鼠单抗1F2竞争性结合同一抗原表位,且竞争作用随着抗体浓度增加而加强。根据50%抑制率时1F2Fab与亲本鼠单抗1F2抗体浓度的比值,可计算出1F2Fab的亲和力为亲本鼠单抗1F2的85%。间接ELISA检测结果表明,抗体的抗原结合活性随着抗体浓度的增加而增强;在相同抗体浓度时,单抗1F2的结合力大于1F2Fab。对1F2Fab抗体进行了初步的体内外中和毒素实验,以鉴定其中和活性。研究结果证实,1F2Fab抗体可抑制天然Stx2毒素对Vero细胞的细胞毒作用,20ng/ml的1F2Fab抗体对Stx2细胞毒作用的抑制率达83%;在动物体内,1F2Fab抗体可中和致死剂量的Stx2毒素,提高攻毒小鼠的存活率,剂量为3200ng/kg的1F2Fab抗体对致死剂量的Stx2攻毒小鼠的保护率达到60%(6/10)。综上所述,1F2Fab和1F2两种抗体的成功制备,为下一步分析它们的药效研究奠定了良好的基础。
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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R392

【参考文献】