大鼠肺泡巨噬细胞ERG钾通道的表达及其功能的初步研究
发布时间：2018-01-03 05:40
本文关键词：大鼠肺泡巨噬细胞ERG钾通道的表达及其功能的初步研究 出处：《第三军医大学》2009年硕士论文 论文类型：学位论文
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【摘要】： ERG(ether-a-go-go-related gene)钾通道属于电压依赖性钾离子通道,在人心肌和脑组织中高表达。越来越多的报道发现该通道与多种病理过程相关,如心律失常、肿瘤等,因此成为近年研究的热点。新近的研究表明,骨髓来源的中枢系统单核-巨噬类细胞——小胶质细胞上存在ERG钾通道。但是,ERG钾通道是否存在于肺泡单核-巨噬细胞,若存在表达,其功能如何?与肺泡巨噬细胞的分泌及吞噬功能有何相关,目前均不清楚。探讨肺泡巨噬细胞ERG钾通道的表达及功能,可为急性肺损伤机制的研究以及治疗提供新的思路。 目的: 1.观察肺泡巨噬细胞上是否有ERG钾通道的表达。 2.初步探讨ERG钾通道与该细胞的分泌及吞噬功能是否相关。 方法 1.大鼠肺泡巨噬细胞ERG钾通道的表达 以大鼠肺泡巨噬细胞系NR8383为研究对象,人肺腺癌细胞系A549为阴性对照,采用RT-PCR方法检测NR8383细胞erg钾通道mRNA的表达,RT-PCR产物进行cDNA测序验证;免疫细胞化学方法和Western blot检测NR8383细胞膜上ERG钾通道蛋白的表达。 2. LPS刺激后大鼠肺泡巨噬细胞系NR8383细胞erg mRNA和蛋白的表达变化 将培养24h的NR8383细胞系,加入LPS 1ug/ml刺激(正常对照组细胞不加),分别于3h、6h、12h、24h提取细胞总RNA和总蛋白采用RT-PCR法和Western-blot法检测ERG钾通道表达的变化。 3.阻断ERG钾通道后大鼠肺泡巨噬细胞吞噬和分泌功能的变化 将细胞分为正常对照组、4-AP阻断组、TEA阻断组、E-4031阻断组。后三组先以相应浓度(分别为1mM、mM、5μM)作用于细胞,阻断钾通道,2h后和正常对照组一起加入制备好的5%鸡红细胞,使鸡红细胞与大鼠肺泡巨噬细胞的比例大概为100:1,置于培养箱中孵育1h。之后用4%的多聚甲醛固定,再行姬姆萨染色,油镜下观察100个AM,计算吞噬率。吞噬率=已吞噬的巨噬细胞数/巨噬细胞总数×100%。放射免疫法检测阻断ERG钾通道后LPS刺激肺泡巨噬细胞分泌炎症因子IL-6的变化,将细胞分为PBS对照组、LPS组、4-AP+LPS组(非特异阻断组)、TEA+LPS组(非特异阻断组)、E-4031(1μM)+LPS组(特异阻断组)、E-4031(5μM)+LPS组(特异阻断组);每组设6个孔。阻断钾通道2h后与LPS组一起加LPS 1ug/ml刺激24h。24h后收集上清,采用放射免疫法检测各组上清液中IL-6的分泌量。 结果 1. RT-PCR及测序结果表明,检测到480bp左右的片段(与预期的一致),表明NR8383细胞有erg mRNA表达,阴性对照A549细胞未见erg mRNA表达。经cDNA测序进一步证实其序列与数据库中序列完全吻合。免疫细胞化学染色显示,大量棕黄色阳性颗粒分布在NR8383细胞膜上,表明NR8383细胞膜上有ERG钾通道蛋白表达,而阴性对照的A549细胞膜上未见棕黄色颗粒。Western blot可以在NR8383细胞蛋白提取物中检测到155kDa和135kDa两条特异的ERG蛋白条带,而阴性对照A549细胞未检测到相应条带。 2. LPS刺激肺泡巨噬细胞后,ERG钾通道mRNA水平和蛋白水平的表达变化 (1)半定量RT-PCR检测不同时间点LPS刺激后erg mRNA表达水平的改变,结果显示:与未经LPS刺激的AM细胞相比,经LPS刺激后6h组erg mRNA表达明显增强,呈明显时间依赖性增加,至所观察的24h组达到最高,为对照组的2倍(P0.05)。 (2)通过Western blot检测LPS刺激后不同时间ERG钾通道蛋白表达水平改变,结果显示:与未经LPS刺激的AM细胞相比,LPS刺激6h后显著增强,至所观察的24h组达到最高,呈时间依赖性增加,为对照组的2倍(P0.05)。 3. ERG钾通道对大鼠肺泡巨噬细胞吞噬和分泌功能的影响 大鼠肺泡巨噬细胞吞噬实验结果显示,与不加ERG钾通道阻断剂的对照组相比,加入特异性阻断剂E4031及非特异阻断剂4AP和TEA的吞噬率显著下降(P0.01),而特异阻断组和非特异阻断组之间的吞噬率无显著差异,提示ERG钾通道参与了AM细胞的吞噬功能。ERG钾通道对大鼠肺泡巨噬细胞炎症因子分泌功能的影响,先用特异阻断剂和非特异阻断剂阻断钾通道,再用LPS刺激AM一定时间后收集上清检测IL-6的分泌功能,结果显示:与未加阻断剂的对照细胞相比,经特异性阻断剂E4031阻断ERG钾通道后,AM细胞分泌IL-6的量显著下降(P0.01),但小剂量(1μM)并无显著影响;而使用非特异性阻断剂4-AP和TEA阻断后,同样能够抑制LPS刺激的IL-6的分泌,而二者之间没有显著差异。以上结果提示:ERG钾通道参与了AM细胞的分泌功能。 结论 1.大鼠肺泡巨噬细胞系NR8383存在erg钾通道mRNA,蛋白表达定位于细胞膜;LPS刺激NR8383细胞后,erg钾通道mRNA和蛋白水平呈时间依赖性升高。 2. ERG钾通道可能与NR8383细胞的吞噬与分泌功能有关,特异性及非特异性阻断剂可降低LPS引起的IL-6分泌和细胞吞噬功能。
[Abstract]:ERG (ether-a-go-go-related gene) potassium channels belong to voltage dependent potassium channel, high expression in human myocardium and brain tissues. More and more reports found the channel with a variety of pathological processes, such as arrhythmia, tumor, therefore become a research hotspot in recent years. Research on recent shows that ERG potassium channel exists in central nervous system bone marrow derived mononuclear macrophage cells, microglia. However, the existence of ERG potassium channel in alveolar macrophages, if there is expression, its function and secretion and phagocytosis? What can the relevant alveolar macrophages, are currently unknown. To investigate the expression and function of ERG potassium in alveolar macrophages the channel, to provide new ideas for the research on the mechanism of acute lung injury and treatment.
Objective:
1. the expression of ERG potassium channel was observed on alveolar macrophages.
2. preliminary study on whether the potassium channel of ERG is related to the secretion and phagocytosis of the cell.
Method
Expression of ERG potassium channel in alveolar macrophages of 1. rats
The rat alveolar macrophage cell line NR8383 as the research object, the human lung adenocarcinoma cell line A549 as negative control, RT-PCR was used to detect the expression of NR8383 cell ERG potassium channel mRNA, RT-PCR products were verified by cDNA sequencing; expression of ERG potassium channel protein of NR8383 cell membrane immunocytochemical method and Western blot detection.
Changes in expression of ERG mRNA and protein in NR8383 cells of alveolar macrophage system of rats after 2. LPS stimulation
The NR8383 cell line of 24h was added to LPS 1ug/ml stimulation (normal control group). The total RNA and total protein were extracted from 3h, 6h, 12h and 24h respectively. The expression of potassium channel was detected by RT-PCR method and Western-blot method.
3. changes of phagocytic and secretory function of alveolar macrophages in rats after blocking ERG potassium channel
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本文编号：1372629
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