治疗性应用于移植的调节性T细胞的体外扩增及共刺激分子B7-1和B7-2对调节性T细胞发育和体内稳态影响

发布时间：2018-01-03 06:01

  本文关键词：治疗性应用于移植的调节性T细胞的体外扩增及共刺激分子B7-1和B7-2对调节性T细胞发育和体内稳态影响　出处：《华中科技大学》2009年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】： 第一部分天然调节性T细胞的分离及两种体外扩增方法的比较 【目的】平行对比分析使用抗体或骨髓分化的树突状细胞(bonemarrow deriveddendritic cell，BM-DC)体外扩增天然调节性T细胞(Treg)的的效率和扩增质量。 【方法】将Treg用生物素偶联的抗体anti-CD25标记后用一步阳性分选法从卵清蛋白(ovalbumin，OVA)特异性TCR转基因小鼠DO11．10外周淋巴组织分离，分别用功能性抗CD3和抗CD28抗体(anti-CD3／CD28)或加载OVA多肽的同系骨髓分化的树突状细胞(bone marraw derived dendritic cell，BM-DC)在高浓度外源性IL-2的辅助下刺激增殖1～4周。检测2种方案的细胞扩增倍数，扩增细胞的活性和纯度，特征性细胞表型以及免疫学特性。 【结果】两种方案均可以扩增出纯度＞90％CD4~+Foxp3~+Treg，虽然扩增的Treg均高表达CD25和Foxp3且保持了Treg的无反应性和特殊的细胞因子分泌谱(不分泌或低分泌IL-2和IFN-γ，高分泌IL-10)，但DC方案的扩增效率更高，扩增的Treg具有更好的活性和纯度 【结论】同系骨髓分化的树突状细胞比抗CD3和抗CD28抗体对Treg具有更高的扩增效率和扩增质量 第二部分扩增调节性T细胞体内外抑制同种异体免疫反应能力的分析比较 【目的】平行比较2种方案扩增的Treg在体内和体外抑制同种异体抗原的直接提呈和间接提呈引发的免疫排斥反应的能力。 【方法】体外功能试验中，将扩增的Treg加入到模拟体内移植物抗宿主病(graftversus host disease，GVHD)和宿主抗移植物病(host versues graft disease，HVGD)直接和间接抗原提呈的3种混合淋巴细胞培养体系中：①BABL/c DC／OVA+B6 CD4~+T，②B6 DC+BABL／c CD4~+T+BABL／c DC／OVA和③Ba DC／OVA／B6 Ag+B6 CD4~+T，检测其免疫抑制活性；在体内功能试验中，扩增Treg和B6 DC过继性输注到预先植入OVA渗透泵的BABL／c小鼠体内，5天后获取淋巴细胞用B6 DC进行继发性刺激检测Treg的免疫抑制活性。用流式仪检测细胞增殖和分泌IFN-γ的效应T细胞比例，用ELISA试剂盒检测上清中的细胞因子IL-2和IFN-γ含量。 【结果】与抗体扩增的Treg相比，，虽然BM-DC扩增的Treg抑制同种异体反应性T细胞增殖的能力略弱，但却能更有效地阻断同种异体反应性T细胞向分泌IFN-γ的效应细胞分化。只有BM-DC扩增的Treg可以在体内存活并抑制宿主对同种异体抗原刺激的免疫反应。 【结论】BM-DC扩增的Treg能更适合于器官移植领域的治疗性应用 第三部分共刺激分子B7-1和B7-2对天然调节性T细胞发育和体内稳态影响 【目的】研究共刺激分子B7-1和B7-2对Freg在胸腺内发育和外周内环境稳定的相对作用，为改进阻断CD28／B7共刺激信号通路的移植耐受方案提供参考。 【方法】用流式细胞仪对比分析野生型及B7-1或(和)B7-2敲除B6小鼠胸腺和外周淋巴组织中CD4~+CD25~+Foxp3~+T细胞的比例，并比较从野生型和B7分子敲除小鼠获得的骨髓分化的树突状细胞(BM-DC)在体外维持和扩增Treg的能力以及刺激同种异体免疫反应的能力。 【结果】虽然B7-1或B7-2的缺失都可引起胸腺内Treg比例下降30％，但是B7-2可维持外周85％的Treg，而B7-1仅能维持65％。另一方面缺乏B7-2而非B7-1提供的共刺激信号可以有效阻断DC刺激同种异体反应T细胞的能力。 【结论】虽然B7-2在维持调节性T细胞外周内环境稳定方面发挥更重要作用，但与完全切断CD28／B7共刺激通路相比，选择性阻断B7-2可以有效地抑制同种异体免疫排斥反应同时对调节性T细胞的影响较小。
[Abstract]:Isolation of the first part of natural regulatory T cells and comparison of two methods of in vitro amplification Objective : To compare the efficiency and amplification quality of natural regulatory T cells ( Treg ) in vitro using antibody or bone marrow differentiated dendritic cells ( BM - DC ) in vitro . Methods : Treg - conjugated antibody anti - CD25 was labeled with anti - CD25 and isolated from peripheral lymphoid tissues of mouse DO11.10 with anti - CD3 and anti - CD28 antibodies or OVA - loaded dendritic cells ( BM - DC ) . The cells were stimulated to proliferate for 1 - 4 weeks with the aid of anti - CD3 and anti - CD28 antibodies or OVA - loaded dendritic cells . Both schemes can amplify the purity of CD4 ~ + Foxp3 ~ + Treg , although the amplified Treg can express CD25 and Foxp3 and maintain the non - reactive and special cytokine secretion spectrum of Treg ( secretion or low secretion of IL - 2 and IFN - 纬 , high secretion of IL - 10 ) , but the amplification efficiency of DC scheme is higher , and the amplified Treg has better activity and purity . Conclusion Compared with anti - CD3 and anti - CD28 anti - CD3 and anti - CD28 antibodies , the dendritic cells differentiated from bone marrow have higher amplification efficiency and amplification quality than anti - CD3 and anti - CD28 antibodies . Comparative analysis of the ability of the second part to amplify the ability of allogeneic immune response in vitro and outside the regulatory T cell body The purpose of this study was to compare the ability of Treg amplified by two protocols to inhibit the direct and indirect extraction of alloantigen in vivo and in vitro . In vitro function test , the amplified Treg was added to three kinds of mixed lymphocyte culture systems : 鈶

本文编号：1372655