重组肺炎链球菌HMGR特性分析及抑制剂筛选

发布时间：2018-01-03 22:30

  本文关键词：重组肺炎链球菌HMGR特性分析及抑制剂筛选　出处：《华中师范大学》2009年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：肺炎链球菌(Streptoccus pneumoniae)是引起脑膜炎、菌血症、肺炎等疾病的主要致病菌,近年来由于环境污染和抗生素的乱用而造成多药抗性的肺炎链球菌菌株逐年增加,对抗生素的抗性逐年增强。HMG-CoA还原酶(HMG-CoA reductase,HMGR)是甲羟戊酸(mevalonate)途径的限速酶,催化HMG-CoA还原为甲羟戊酸。本研究从肺炎链球菌基因组DNA中PCR扩增出mvaA基因全长1275bp的完整编码序列,将其克隆到pMD18-T载体中,转化大肠杆菌DH5α。重组质粒经HindⅢ和BamHI双酶切分析并测序证实的阳性重组子亚克隆到pET-28a(+)表达载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3)。在30℃以1mM IPTG诱导表达,Ni-NTA层析柱分离纯化后经SDS-PAGE分析表明在约47kD处有特异性表达带。肺炎链球菌HMGR以NADPH作为辅酶,动力学分析采用紫外分光光度法检测NADPH在340nm处吸收值的变化。检测结果表明肺炎链球菌HMGR的最适pH约为6.5,最适温度37℃。粗酶提取物的比活为11.22U/mg,分离纯化后比活为31.98U/mg,比活提高2.8倍。在37℃,pH6.5时的Vmax和Km分别为62.1U/mg和260μM。罗伐他汀是HMGR的竞争性抑制剂,对肺炎链球菌HMGR的抑制常数Ki为362μM。表达纯化后的重组HMGR免疫新西兰大白兔,提取抗血清,ELISA检测其效价为1:320000,Western杂交证明HMGR具有特异性杂交条带。 序列分析表明,HMGR主要存在两类,Ⅰ类主要存在于真核生物和部分古细菌中,Ⅱ类主要存在于原核生物和部分古细菌中。他汀类药物是Ⅰ类HMGR的良好竞争性抑制剂,其Ki常数在nM范围内,但是他汀类药物对Ⅱ类HMGR的抑制效果并不明显,其Ki值在μM范围内。为了寻找更专一有效的针对Ⅱ类HMGR的竞争性抑制剂,本文以假单孢杆菌HMGR晶体结构为模板,通过SYBYL7.0软件,用同源模建的方法分析了肺炎链球菌HMGR的三维结构,根据其同源模建和三维结构筛选HMGR的竞争性抑制剂。用重组表达的肺炎链球菌HMGR,检测筛选到的抑制剂的抑制效果。初步分析结果表明,在待筛选的30种化合物中,筛选到一种比传统的竞争性抑制剂罗伐他汀具有更佳抑制效果的化合物,其抑制常数Ki约为76μM,此种化合物可作为进一步研究新型抗菌药物的预选药物。目前,以计算机分析三维结构为手段,用同源模建的方法寻找结构类似物来研究新药的开发是一种有效的途径,本实验为进一步寻找专一性的特效抑制剂奠定了基础。
[Abstract]:Streptoccus pneumoniae is the main pathogen causing meningitis, bacteremia, pneumonia and other diseases. In recent years, Streptococcus pneumoniae strains with multi-drug resistance caused by environmental pollution and indiscriminate use of antibiotics increased year by year. HMG-CoA reductase (HMG-CoA reductase) is the rate-limiting enzyme of mevalonate pathway. In this study, the complete coding sequence of mvaA gene 1275bp was amplified from the genomic DNA of Streptococcus pneumoniae by catalytic reduction of HMG-CoA to mevalic acid. It was cloned into pMD18-T vector. The recombinant plasmid was subcloned into the expression vector pET-28a (pET-28a ()) by Hind 鈪，

本文编号：1375901