脾细胞联合抗CD154单抗的非清髓异基因骨髓移植诱导大鼠胰腺移植耐受

发布时间：2018-01-05 14:14

本文关键词：脾细胞联合抗CD154单抗的非清髓异基因骨髓移植诱导大鼠胰腺移植耐受　出处：《昆明医学院》2008年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 目的建立异基因大鼠全胰十二指肠移植(WPDT)模型,并探讨手术过程操作要点,为研究术后排斥反应提供实验手段。方法采用60 mg/Kg链尿佐菌素(STZ)一次性腹腔注射建立Wistar大鼠Ⅰ型糖尿病模型。在原有建模的经验基础之上改进动脉吻合方式,将供受体腹主动脉端侧吻合,供体门静脉与受体左肾静脉袖套吻合,供体十二指肠与受体小肠端侧吻合,成功建立Lewis→Wistar糖尿病大鼠异基因WPDT模型。对移植成功的受鼠3次/周监测血糖,并记录存活时间(ST),术后第7天取材3只大鼠移植物行病理学检查。结果STZ诱导糖尿病大鼠成模率为85.7%,酮症酸中毒(DKA)发生率为5.6%,病死率7.4%。50只糖尿病大鼠行WPDT术式,44例移植成功,术后24h血糖由术前(22.83±4.37)mmol/L降至(6.36±2.18)mmol/L。其中有8例于术后3d内死亡,其余36例受鼠存活时间为6～16d,平均为(10.45±3.3)d,术后4d、7d、10d、13d血糖水平呈进行性升高,术后7～10d为死亡高峰,移植物病理改变呈典型的急性排斥反应。结论STZ诱导糖尿病模型成功率高,对机体其它脏器毒性小,动物模型稳定。熟练操作技术,重视细小环节,是成功建立WPDT模型的关键因素。本法建立的WPDT模型可见到移植胰发挥内分泌功能以及典型的急性排斥反应病理改变,可用于排斥反应的研究。目的探讨供体脾细胞门静脉输注联合抗CD154单克隆抗体(anti CD154mAb)的非清髓性骨髓移植预处理方案在异基因大鼠胰十二指肠移植(PDT)免疫耐受诱导中的作用及可能机制。方法一次性腹腔推注链尿佐菌素60 mg/Kg建立Wistar(Rt1~u)大鼠Ⅰ型糖尿病模型。以Lewis(Rt1~1)大鼠为供体,糖尿病Wistar大鼠为受体,SD大鼠为无关第三品系。受体随机分为3组,每组13只:移植组,行Lewis→Wistar PDT,移植术前、后不进行任何处理;单抗组,PDT术后腹腔注射3mg anti CD154 mAb;耐受组,按耐受诱导方案进行。方案为:第0天,经受鼠门静脉输注供体来源的脾细胞2×10~8,2h后腹腔注射3mg anti CD154mAb;第3天,经受鼠阴茎背静脉输注供体来源的骨髓细胞1×10~8;第20天,行PDT。术后第7天,各组随机取6只行血糖水平测定,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清IL-10和IFN-γ水平;取材移植物行病理检查,TUNEL-POD法检测原位细胞凋亡以及吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)免疫组化分析;流式细胞术对受鼠脾、胸腺Rt1~(1+)水平进行嵌合体测定;同时行单向混合淋巴细胞反应(MLR),大鼠重组白细胞介素2(IL-2)逆转实验和体内过继转移实验。各组剩余的7只用于移植物功能存活时间观察。结果PDT术后第7天,耐受组血清IL-10为(188.42±23.15)pg/mL,显著高于移植组和单抗组;IFN-γ浓度为(202.46±24.07)pg/mL,显著低于其余两组;Th1/Th2细胞因子平衡向Th2偏移。病理学检查发现,移植组与单抗组移植物病变均呈典型的急性排斥反应,组织学评分分别为(4.67±0.52)分和(4.00±0.63)分,差异无显著性(P=0.104);而耐受组移植物排斥反应以Ⅱ～Ⅲ级为主,评分为(2.67±0.82)分,病变明显轻于前两组(P＜0.01);十二指肠排斥反应程度与胰腺基本一致。术后三组移植物均可检测到细胞凋亡,而耐受组细胞凋亡数显著少于其余两组(P＜0.01)。免疫组化结果提示,各组移植物IDO表达均无显著性差异(P＞05),胰腺腺泡细胞、十二指肠黏膜上皮细胞及淋巴细胞均呈强阳性表达,IDO表达部位为胞浆。嵌合体检测,只有耐受组大鼠的脾脏、胸腺内可检测到Rt1~(1+)嵌合细胞,嵌合水平分别为(31.56±6.57)%和(22.04±8.12)%。单向MLR实验中,耐受组对Lewis大鼠脾细胞的刺激指数百分率(SI%)为(26.41±5.16)%,显著低于移植组和单抗组(P＜0.01);而单抗组对Lewis和SD供体脾细胞的刺激均有一定的抑制作用。外源性IL-2可完全或部分逆转上述两个MLR体系中的抑制效应。体内过继转移实验结果显示耐受组大鼠体内存在调节/抑制性T细胞。移植组和单抗组均不能延长移植物功能平均存活时间(MIST),而耐受组可将MST延长到(21.83±1.11)天。结论单独使用anti CD154 mAb的单抗组不能有效建立嵌合体、诱导免疫耐受,在此基础上联合供体脾、骨髓细胞,可在糖尿病大鼠体内建立异基因混合性嵌合体并在含有两个高免疫原性器官的PDT中诱导机体特异性免疫耐受,减轻移植物排斥反应程度,延长移植物功能MST。诱导方案发挥致免疫耐受作用不依赖于IDO活性表达,联合两种方法可能具有协同作用。免疫耐受形成的可能机制包括外周、中枢性嵌合体的建立、Th1/Th2细胞因子平衡偏离、通过抑制细胞过度凋亡参与T细胞克隆清除、克隆无能以及调节/抑制等外周耐受机制。
[Abstract]:Objective To establish a model of pancreatic duodenal transplantation ( WPDT ) in rats with allogene - induced diabetic rats . Objective To investigate the effects of donor spleen cell portal vein infusion combined with anti - CD154 monoclonal antibody ( anti - CD154 mAb ) on immune tolerance induced by pancreatic duodenal transplantation ( PDT ) in rats .

【学位授予单位】：昆明医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R392.4

【参考文献】