干扰素-α对神经细胞中p11表达的影响

发布时间：2018-01-07 01:05

  本文关键词：干扰素-α对神经细胞中p11表达的影响　出处：《新乡医学院》2013年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：背景 IFN-α在临床上应用广泛,如抗病毒、抗肿瘤。但是其中的一个不良反应,就是长期应用会出现精神抑郁,而且发病率比较高,这就大大限制了IFN-α的临床应用。目前,IFN-α引起抑郁的机制还有得进一步研究。研究报道脑内特定区域p11蛋白表达的降低与抑郁症有着密切的关系,并且p11能够转运5-羟色胺受体1B(5HTR1B)、5-羟色胺受体4(5HTR4)到细胞膜,影响两者在细胞膜上的表达。目的探讨IFN-a对人神经细胞中p11表达的影响。 方法 1.p11-cmv-flag表达基因的构建：提取SH-SY5Y细胞总的RNA,逆转录成cDNA,根据已知人的p11基因表达序列设计两端引物,以cDNA为模板进行扩增,获得的产物含p11表达基因的全长。HindⅢ和EcoRI双酶切p11cDNA扩增产物和Flag-cmv载体,双酶切后分别将两者进行连接反应即获得p11-cmv-flag质粒。 2.p11蛋白表达的检测：将p11-cmv-flag表达质粒和Pcmv-flag空质粒利用脂质体分别转入SH-SY5Y细胞中,检测p11-flag表达的情况。 3. IFN-α对p11mRNA表达的影响：分别用不同浓度(0、50、500、1000、2000、3000IU/ml)的IFN-α刺激SH-SY5Y细胞18小时后,提取细胞总的RNA,逆转录,Real Time PCR检测p11mRNA的表达变化。每组设两个复孔,实验重复三次。 4. IFN-α对p11蛋白表达的影响：分别用不同浓度(0、50、500、1000、2000、3000IU/ml)的IFN-α刺激SH-SY5Y细胞24小时后,提取细胞总的蛋白,westernblot法检测P11蛋白的表达变化；用1000IU/ml的IFN-α分别刺激细胞Oh、6h、12h、24h、36h、48h后,提取细胞总的蛋白,westemblot法检测p11蛋白表达变化。实验重复三次。 5. IFN-α对p11蛋白在胞内分布的影响：培养SH-SY5Y细胞,分别用不同浓度(0、500,3000IU/ml)的IFN-α刺激SH-SY5Y细胞24小时后,通过固定、封闭、一抗、二抗反应后,在免疫荧光共聚焦显微镜下观察p11蛋白的表达。 6.统计学分析：应用SPSS17.0统计软件进行数据处理和分析,实验结果以均数±标准差(x±s)表示,采用单因素方差分析,两组均数比较用t检验,P0.05为差异有统计学意义。 结果 1.成功构建p11-cmv-flag表达质粒,质粒测序结果与NCBI提供序列完全匹配。 2. Western Blot结果显示p11-cmv-flag表达质粒能够在SH-SY5Y细胞中成功表达。 3.IFN-α能够降低SH-SY5Y细胞p11mRNA的表达水平。 4.IFN-α能够降低SH-SY5Y细胞p11蛋白的表达水平。 5.免疫荧光共聚焦检测,SH-SY5Y细胞实验组p11蛋白处理组平均绿色荧光强度显著低于对照组,IFN-α能够抑制p11在SH-SY5Y细胞胞膜内表面的聚集。 结论IFN-α能诱导人神经细胞中p11表达量的减少。
[Abstract]:Background IFN- 伪 is widely used in clinical practice, such as antiviral, anti-tumor. But one of the adverse reactions is long-term use of mental depression, and the incidence is relatively high. This greatly limits the clinical application of IFN- 伪. The mechanism of depression induced by IFN- 伪 has been further studied. It is reported that the decrease of p11 protein expression in specific regions of brain is closely related to depression. Moreover, p11 can transport 5-hydroxytryptamine receptor (5HTR4) to the cell membrane. Objective to investigate the effect of IFN-a on the expression of p11 in human nerve cells. Method 1. Construction of p11-cmv-flag expression gene: total RNAs of SH-SY5Y cells were extracted and reverse transcripted into cDNA. According to the known expression sequence of human p11 gene, the primers were designed and amplified using cDNA as template. The obtained product contains the full-length. Hind 鈪，

本文编号：1390303