睾丸抗原OY-TES-1羧基端截短蛋白的制备及鉴定
本文关键词：睾丸抗原OY-TES-1羧基端截短蛋白的制备及鉴定 出处：《广西医科大学》2009年硕士论文 论文类型：学位论文
【摘要】： 目的:构建OY-TES-1羧基端截短蛋白(OY-TES-1-C)重组质粒、体外表达OY-TES-1-C蛋白,对表达产物进行纯化和鉴定,为OY-TES-1后续研究奠定基础。 方法:(1)提取人睾丸组织总RNA,逆转合成cDNA;(2)扩增OY-TES-1羧基末端253(S291-G543)个氨基酸的cDNA序列;(3)将PCR扩增产物插入原核表达载体pMAL-C2,构建pMAL-C2-OY-TES-1-C重组质粒,并转化DH5α菌进行pMAL-C2-OY-TES-1-C重组质粒扩增;(4)通过蓝白斑筛选、DNA测序筛出正确的pMAL-C2-OY-TES-1-C重组质粒,将重组质粒转化Rosetta菌;(5)用IPTG对重组菌进行诱导表达,优化IPTG使用的浓度和加入时机,以及诱导温度和诱导时间;(6)在优化条件下表达融合蛋白MBP-OY-TES-1-C,通过Amylose-resin亲和层析柱纯化;(6)将纯化后的MBP-OY-TES-1-C蛋白进行Western Blot鉴定。 结果:重组质粒pMAL-C2-OY-TES-1-C测序与已知序列相同;成功诱导表达出融合蛋白MBP-OY-TES-1-C。确定了pMAL-C2- OY-TES-1-C体外表达的优化条件:37℃振荡培养3小时,加入IPTG(终浓度为0.7mmol/L),然后在32℃振荡培养4小时;表达出与预计分子量符合的融合蛋白。 结论:成功构建了pMAL-C2-OY-TES-1-C重组质粒,通过E.coli表达出MBP-OY-TES-1-C融合蛋白。
[Abstract]:Objective: to construct OY-TES-1 carboxy terminal truncated protein (OY-TES-1-C) recombinant plasmid, express OY-TES-1-C protein in vitro, and purify and identify the expressed product, so as to lay the foundation for subsequent research of OY-TES-1.
Methods: (1) total RNA was extracted from human testicular tissue, the reversal of the synthesis of cDNA; (2) amplification of OY-TES-1 carboxyl terminal 253 amino acid sequence of cDNA (S291-G543); (3) the PCR gene fragment was inserted into the prokaryotic expression vector pMAL-C2 to construct the recombinant plasmid of pMAL-C2-OY-TES-1-C, were amplified and recombinant plasmid pMAL-C2-OY-TES-1-C into E.coli DH5 (; 4) by blue white screening, the recombinant pMAL-C2-OY-TES-1-C plasmid DNA sequencing to screen out correctly, the recombinant plasmid was transformed into Rosetta bacteria; (5) the recombinant strain was induced and expressed by IPTG, IPTG and the use of optimal concentration and adding time, induction temperature and time; (6) under the optimized conditions the expression of fusion protein MBP-OY-TES-1-C. Purified by Amylose-resin affinity chromatography; (6) the purified MBP-OY-TES-1-C protein by Western Blot identification.
Results: the recombinant plasmid pMAL-C2-OY-TES-1-C sequencing with the known sequence of the same; expression of MBP-OY-TES-1-C. fusion protein to determine the optimal conditions of expression of pMAL-C2- OY-TES-1-C in vitro: 37 DEG C for 3 hours, adding IPTG (final concentration 0.7mmol/L), and then cultured for 4 hours at 32 DEG C oscillation; express with the expected molecular weight of the fusion protein with.
Conclusion: the recombinant plasmid of pMAL-C2-OY-TES-1-C was successfully constructed and the MBP-OY-TES-1-C fusion protein was expressed through E.coli.
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R392
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，本文编号：1397600
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