组织型纤溶酶原激活剂基因逆转录病毒载体靶向溶栓效应
本文关键词：组织型纤溶酶原激活剂基因逆转录病毒载体靶向溶栓效应 出处：《华中科技大学》2008年博士论文 论文类型：学位论文
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【摘要】： 第一部分pLEGFP-N1-tPA逆转录病毒载体构建、鉴定及包装细胞PT67/pLEGFP-N1-tPA纯系培育 目的构建含人组织型纤溶酶原激活剂(tissue-type plasminogen activator, tPA)基因增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)基因逆转录病毒载体及产高滴度病毒的纯包装细胞系。 方法用PCR方法扩增目的基因tPA,定向克隆入逆转录病毒载体(pLEGFP-N1)中,酶切反应、PCR及DNA测序鉴定重组逆转录病毒载体pLEGFP-N1-tPA;在基因转染试剂SofastTM介导下将pLEGFP-N1-tPA转入包装细胞PT67,经相应的抗生素筛选、标记、显微移出,培育出全EGFP纯包装细胞系。用NIH3T3细胞测定病毒滴度。 结果经限制性酶切分析、DNA序列分析、EGFP的表达证实pLEGFP-N1-tPA中含有tPA基因。转染有pLEGFP-N1-tPA的纯PT67细胞产病毒滴度为1×10~7CFU/ml。 结论成功构建了pLEGFP-N1-tPA载体和产高滴度病毒纯包装细胞系,为tPA局部靶向治疗的理想人工心瓣的研究和应用奠定了实验基础。 第二部分pLEGFP-N1-tPA感染ECUV304和心肌细胞,ECUV304/ pLEGFP-N1-tPA建纯系 目的观察pLEGFP-N1-tPA感染ECUV304和心肌细胞后,ECUV304/pLEGFP-N1-tPA纯系上清和感染后心肌细胞上清在体外血栓模型中溶栓情况及tPA表达情况。 方法pLEGFP-N1-tPA感染ECUV304细胞,单个强表达EGFP的ECUV304细胞→成簇→显微移出→培育→成纯系。建体外血浆平板血栓模型(用人全血),纯系ECUV304/pLEGFP-N1-tPA培养上清加入模型中,设对照组,观察溶解血栓情况,同时椐蚓激酶活性算出tPA活性。ELISA测出tPA含量。Western blot检测tPA。原代1-4d乳鼠心肌细胞培养,感染pLEGFP-N1-tPA,培养上清加入血浆平板血栓模型,设对照组,观察溶解血栓情况,算出tPA活性,测出tPA含量。Western blot检测tPA。 结果转导有pLEGFP-N1-tPA的内皮细胞和心肌细胞培养细胞上清在体外血栓模型中有大的溶解圈。ECUV304/pLEGFP-N1-tPA纯系上清tPA活性是502.16u/10~6 cells/24h,tPA含量是716.27ng/10~6 cells/24h,Western blot检出外源tPA条带。心肌细胞/pLEGFP-N1-tPA上清tPA活性是464.27u/10~6 cells/24h,tPA含量是607.34ng/10~6 cells/24h,Western blot亦检出外源tPA条带。 结论成功建立ECUV304/pLEGFP-N1-tPA纯系,纯系上清有明显溶栓作用,tPA活性及含量均高,有外源tPA条带。心肌细胞/pLEGFP-N1-tPA上清有明显溶栓作用,tPA活性及含量均高,有外源tPA条带。 第三部分在体研究特氟隆(Dacron)片移植入兔下腔静脉,Dacron片周围局部转导pLEGFP-N1-tPA 目的探讨组织型纤溶酶原激活剂(tPA)基因局部转导对特氟隆(Dacron)片(与机械瓣瓣环同质)的溶血栓作用。 方法70只兔建立下腔静脉内Dacron片植入血栓模型,随机分为pLEGFP-N1-tPA治疗组(n=30)、pLEGFP-N1空载体对照组(n=20)、空白对照组(n=20),局部基因转导,于术后2d、75d各组一半动物取材(6个亚组A1、B1、C1、A2、B2、C2),聚光共聚焦(confocal)观察所取静脉增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达,体视镜和电镜观察Dacron片表面血栓情况,免疫印迹(Western blot)、血浆平板和酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)分别检测所取静脉tPA表达、溶栓、活性及含量变化。 结果术后2d和75d取材,治疗组所取静脉,confocal均观察到多而强的EGFP表达,pLEGFP-N1对照组也有EGFP表达,但空白对照组无EGFP表达。70个Dacron片加未植入组10个Dacron片共80个,在体视镜(×160倍)和电镜(×500倍)下观察,未植入组和治疗组Dacron片表面均无血栓,对照组表面均有血栓。治疗组所取静脉Western blot检测均有外源tPA表达,对照组未检测到。血浆平板显示:治疗组均有大的溶解圈,有明显溶栓作用,对照组没有;根据蚓激酶计算出的纤溶活性显示:治疗组术后2d和75d所取静脉tPA活性分别为529.62±9.05u/g、537.50±12.45u/g,两时间点比较,差异显著性(P0.05)。术后2d和75d治疗组、两对照组中6个亚组所取静脉tPA含量分别为(A_1 737.64±13.19)、(B_1 29.88±5.61)、(C_1 28.71±5.49)、(A_2 742.87±10.56)、(B_2 32.03±6.26)、(C_2 31.34±5.63)ng/g,治疗组明显高于对照组(P0.01);治疗组中两时间点比较,tPA含量无显著差异(P0.05)。 结论pLEGFP-N1-tPA局部基因转导能有效阻止外源移植物表面血栓形成,为研究和应用tPA基因瓣膜奠定了基础。
[Abstract]:The first part of pLEGFP-N1-tPA retroviral vector construction, identification and culture of PT67/pLEGFP-N1-tPA pure line culture
Objective to construct a retroviral vector containing tissue-type plasminogen activator (tPA) gene enhanced green fluorescent protein (enhanced green fluorescent protein, EGFP) gene and a pure package cell line producing high titer virus.
Methods tPA gene was amplified by PCR, cloned into retroviral vector (pLEGFP-N1), enzyme digestion and DNA sequencing, PCR pLEGFP-N1-tPA recombinant retroviral vector; gene transfection reagent in SofastTM mediated pLEGFP-N1-tPA into PT67 packaging cells by corresponding antibiotic screening, marking, micro removed, cultivate full EGFP pure packaging cell line. The virus titer was determined by NIH3T3 cells.
Results restriction endonuclease analysis, DNA sequence analysis and EGFP expression confirmed that pLEGFP-N1-tPA contained tPA gene. The titer of pure PT67 cells transfected with pLEGFP-N1-tPA was 1 * 10~7CFU/ml..
Conclusion pLEGFP-N1-tPA vector and highly titre virus pure packaging cell line were successfully constructed, which laid an experimental foundation for the research and application of tPA ideal targeted artificial heart valve.
The second part of pLEGFP-N1-tPA is infected with ECUV304 and cardiomyocytes, and the pure line of ECUV304/ pLEGFP-N1-tPA
Objective To observe thrombolysis and tPA expression in pure thrombolytic system and supernatant of myocardium after infection of ECUV304 and cardiomyocytes by pLEGFP-N1-tPA in vitro thrombus model of ECUV304/pLEGFP-N1-tPA.
Methods pLEGFP-N1-tPA infection of ECUV304 cells, a strong expression of EGFP in ECUV304 cells, and to nurture and remove the micro clusters into pure lines. Built in vitro plasma plate thrombosis model (with human blood), pure ECUV304/pLEGFP-N1-tPA culture supernatant was added into the model, the control group, observation of thrombus dissolution, at the same time according to the activity of LK calculate the tPA activity of.ELISA tPA.Western blot to detect tPA. content measured in primary cultured rat myocardial cells infected with 1-4d, pLEGFP-N1-tPA, supernatant into plasma plate thrombosis model, control group, observation of dissolving thrombus, calculate the activity of tPA, content of tPA.Western blot tPA. detection measure
Results transduction of endothelial cells and myocardial cells pLEGFP-N1-tPA cell culture supernatant in vitro thrombosis model in active dissolution circle.ECUV304/pLEGFP-N1-tPA pure tPA is 502.16u/10~6 supernatant cells/24h, tPA content is 716.27ng/10~6 cells/24h, Western blot in the detection of exogenous tPA bands. The myocardial cells of /pLEGFP-N1-tPA supernatant tPA activity is 464.27u/10~6 cells/24h, tPA 607.34ng/10~6 cells/24h Western content. Blot detection of exogenous tPA bands.
Conclusion ECUV304/pLEGFP-N1-tPA pure line was successfully established, pure line supernatant had obvious thrombolytic effect, tPA activity and content were high, and exogenous tPA band. Cardiomyocyte /pLEGFP-N1-tPA supernatant had obvious thrombolytic effect, tPA activity and content were high, and exogenous tPA band.
In the third part of the body of Teflon (Dacron) graft into the rabbit inferior vena cava, Dacron around the local transfer of pLEGFP-N1-tPA
Objective to investigate the tissue plasminogen activator (tPA) gene transduction on local Teflon (Dacron) tablets (with mechanical valve ring homogeneous) thrombolytic effect.
Methods 70 rabbits were established in Dacron implanted inferior vena cava thrombosis model, were randomly divided into pLEGFP-N1-tPA treatment group (n=30), pLEGFP-N1 empty vector control group (n=20), control group (n=20), local gene transduction, postoperative 2D, 75D groups were half animal (6 sub groups A1, B1, C1 A2, B2, C2), spotlight, confocal (confocal) to observe the vein of enhanced green fluorescent protein (EGFP) expression, body mirror and electron microscopic observation of surface thrombosis Dacron slices, immunoblotting (Western blot), plasma panel and enzyme-linked immunosorbent assay (enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) were detected respectively. The expression of tPA in vein, thrombolysis, changes of activity and content.
Results after 2D and 75D treatment group were taken from vein, confocal were observed and the strong expression of EGFP, pLEGFP-N1 groups had EGFP expression, but the control group the expression of EGFP.70 Dacron tablets and non implanted group 10 Dacron tablets a total of 80, in the stereoscope (x 160) and the electric mirror (x 500) observed under the non implanted group and treatment group Dacron surface showed no thrombosis, the surface of the control group were taken venous thrombosis. The treatment group Western blot detection showed that exogenous tPA expression was not detected in control group. The plasma panel display: the treatment group had a large circle of dissolution, obvious thrombolysis no, the control group; calculated according to Lumbrokinase fibrinolytic activity showed that the treatment group postoperative 2D and 75D venous tPA activity were 529.62 + 9.05u/g, 537.50 + 12.45u/g, two time points, significant difference (P0.05). Group 2D and 75D after treatment, two and 6 in control group a subgroup of the T vein The content of PA was (A_1 737.64 + 13.19), (B_1 29.88 + 5.61), (C_1 28.71 + 5.49), (A_2 742.87 + 10.56), (B_2 32.03 32.03 6.26), (C_2 31.34, 31.34) ng/g, the treatment group was significantly higher than that of the control group (P0.01), and the tPA content in the treatment group had no significant difference (P0.05).
Conclusion pLEGFP-N1-tPA local gene transduction can effectively prevent the formation of external graft surface thrombosis, which lays the foundation for the study and application of tPA gene valve.
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R346
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