急性移植排斥反应过程中HLA-G表达动态变化的实验及临床研究

发布时间：2018-01-10 11:02

本文关键词：急性移植排斥反应过程中HLA-G表达动态变化的实验及临床研究　出处：《山东大学》2009年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 背景: 器官和组织移植是20世纪的医学壮举,为挽救人类生命做出了超乎寻常的贡献。随着组织配型、器官保存、移植手术、术后抗感染等一系列临床技术的不断进步,移植器官的存活率以及患者的生活质量和生存率都得到了很大的提高,使得器官移植成为治疗终末期器官功能衰竭最有效的治疗手段。然而,移植术后的排斥反应,尤其是急性排斥反应,仍然是导致移植器官功能丧失、甚至患者死亡最主要的原因。尽管移植物局部组织的病理活检可以对排斥反应做出明确诊断,而且一直被公认为是诊断移植排斥反应的金标准,但由于其具有创伤性、容易诱发并发症等缺点,在临床上难以成为常规的检查手段;临床常用的生化学等检查只有在移植器官组织结构明显异常,影响到器官功能时才能做出诊断。而目前研究较多的细胞因子、抗体等检查,则往往由于其准确性、敏感性、特异性方面的不足而无法得到广泛的应用。到目前为止,仍没有一种可以及时、准确诊断排斥反应的公认的检测方法。在无法准确了解患者免疫状态的情况下,免疫抑制剂是预防排斥反应发生的最有效的手段,但过量的免疫抑制剂往往导致严重感染和肿瘤等恶性疾病的发生。因此如何通过一种无创性的检测方法准确地反映患者的免疫状态并及时发现、预测排斥反应的发生是移植研究领域一个亟待解决的重大课题。只有这样,才能在预防排斥反应和减少免疫抑制剂用量之间寻找到一个适宜的平衡点,制定个性化的治疗方案,达到最佳的治疗效果。以往相关研究主要从淋巴细胞活化的角度加以研究,但从另一方面看,移植术后稳定的患者大多处于免疫抑制或免疫耐受状态,而发生排斥的患者则是打破了业已建立的免疫抑制状态而使得免疫细胞重新激活并发挥同种异体杀伤作用。那么能否从免疫耐受的角度着手,借观察宿主免疫耐受相关因素的变化来预测排斥反应的发生呢? 胚胎植入是诱导免疫耐受最成功的典范,从本质上看,胚胎植入的过程,其实就是母体对带有父方异体抗原成分的胚胎的免疫耐受过程。器官移植和胚胎植入是两个密切相关的研究领域,虽然同样是同种异体之间的免疫应答,胚胎植入和器官移植的结局却截然相反,这其中涉及很多种蛋白和分子的参与。其中非经典主要组织相容性复合体(MHC),尤其是HLA-G的差异性表达,引起了越来越多胚胎学研究和病理妊娠研究领域专家的重视。 HLA-G是一种非经典MHC-Ⅰ类抗原,与经典MHC-Ⅰ类抗原的基因高度同源,蛋白结构也很相似。不同的是,HLA-G分子不具有丰富的多态,也不像经典MHC-Ⅰ抗原那样分布广泛。生理状态下HLA-G仅表达于胚胎滋养层和一些免疫豁免部位。从功能上看,HLA-G分子可与NK细胞、T细胞和APC细胞等免疫细胞的抑制性受体结合,传递抑制性信号,从而抑制母体免疫细胞的活性,诱导母体对胚胎抗原的免疫耐受。母胎界面HLA-G表达下降与流产、子痫等病理妊娠的发生密切相关。胚胎学的研究成果为器官移植免疫的研究提供了新的思路。那么从器官移植的角度来看,移植术后HLA-G的表达是否呈现出规律性的变化?排斥反应发生时,HLA-G的表达是否会有相应的变化?是否有助于临床上排斥反应的诊断呢?免疫抑制剂对机体HLA-G的表达有怎样的影响作用呢?这一系列问题尚未引起人们的重视。如果解决了上述问题,将有助于阐述HLA-G分子在器官移植中的作用机制,为临床排斥反应的诊断提供新的思路。临床上,移植受者术后常规接受免疫抑制剂治疗以诱导耐受,因此难以区分移植排斥反应和免疫抑制剂对HLA-G的不同作用,因而有必要利用动物模型来系统研究移植排斥反应发生过程中HLA-G分子表达的变化规律,并独立探讨免疫抑制剂对其的影响作用。小鼠的Qa-2分子与人类HLA-G分子在结构和功能上均具有高度的同源性,而且纯系小鼠之间的皮肤移植模型是最经典的排斥反应动物模型,手术简便,易于观察。因此小鼠皮肤移植模型成为本次研究的理想动物模型。为了系统的研究移植排斥反应发生过程中HLA-G分子表达的变化规律以及免疫抑制剂的影响作用,我们首先以近交系小鼠皮肤移植模型研究了移植术后不同时间移植物、浸润淋巴细胞、外周血淋巴细胞(PBLs)以及血浆中Qa-2的表达,分析了其与移植排斥反应分级之间的相关性和不同剂量免疫抑制剂的影响作用。并在动物研究的基础上,动态监测了临床肾移植术后稳定患者和排斥患者术后不同时间外周血单个核细胞以及血浆HLA-G的不同表达,探讨了HLA-G对移植物排斥反应的诊断价值,并分析了其与患者免疫耐受状态之间的关系,以期为临床制定个性化免疫抑制方案提供实验依据。目的: 1、利用成功建立的小鼠皮肤移植模型,动态监测用药和不用药状态下移植受者术后不同时间小鼠Qa-2分子在移植物、浸润淋巴细胞、外周血淋巴细胞、血浆中的表达变化,揭示移植受者Qa-2分子在移植排斥反应发生过程中的变化规律,探讨其与同种异体急性移植排斥反应发生进程之间的对应关系。 2、通过检测不同种类、不同剂量免疫抑制剂单一或联合作用下小鼠Qa-2表达的变化,分析免疫抑制剂种类和剂量对Qa-2表达的不同作用,探讨Qa-2表达对机体免疫抑制状态的监测价值,以期为指导临床制定个性化治疗方案提供实验依据。 3、动态监测肾移植患者术前和术后不同时间外周血单个核细胞HLA-G转录和蛋白水平以及血浆可溶性HLA-G表达的变化规律,对比稳定组和排斥组的差异,探讨HLA-G对于移植排斥反应的诊断价值、最佳检测方法以及对患者免疫状态的监测作用。方法: 1.建立小鼠皮肤移植动物模型:为研究不同鼠系之间的差别,分别以SPF级近交系C57BL/6(简称C57)和BALB/C(简称BA)两种鼠系作为研究对象,分别随机分为正常对照组和手术组,其中手术组又分为自身移植组、同系移植组和异系移植组。为了观察免疫抑制剂的影响,同系和异系移植组又分别分为不用药组和用药组。用药组模拟临床环孢素A(CsA)、皮质激素(Horm)及霉酚酸酯(MMF)中等剂量三联用药。手术组采用经典的小鼠背—背皮肤移植手术方法,建立动物模型,术后每天观察皮肤移植物大体改变,记录肉眼排斥时间。每天取移植皮片进行HE染色,根据移植物病理组织学改变将其分为排斥反应Ⅰ-Ⅳ级,记录移植物病理排斥进展情况。观察用药和不用药对移植物存活时间和病理组织学改变的影响 2.动态检测移植术后Qa-2的表达:利用成功建立的小鼠皮肤移植模型,术后每天每组处死5只小鼠,采集移植皮片、外周血淋巴细胞和血浆,采用免疫组化、Real-Time荧光定量PCR、流式细胞术和ELISA等方法动态监测不同组别小鼠移植受者术后不同时间点小鼠Qa-2分子在移植物、浸润淋巴细胞、外周血淋巴细胞、血浆中的表达变化,分析上述指标与排斥反应发生和免疫抑制剂应用之间的关系。 3.免疫抑制剂对Qa-2表达的影响:将SPF级C57BL/6小鼠随机分为对照组、环孢素组、激素组、霉酚酸酯组和联合用药组,其中三种单一用药组又分为低、中低、中等、中高、高共5个剂量组,收集外周血淋巴细胞、血浆以及移植物,采用Real-Time荧光定量PCR、流式细胞术、ELISA及免疫组化等方法检测不同种类、不同剂量免疫抑制剂单一作用或联合作用下小鼠Qa-2表达的变化,分析了免疫抑制剂种类和剂量对Qa-2表达的不同作用,探讨了Qa-2表达对机体免疫抑制状态的监测价值,以期为指导临床制定个性化治疗方案提供实验依据。 4.肾移植患者HLA-G的动态监测:连续收集57例肾移植患者(其中术后32例肾功能稳定、25例发生急性排斥反应)术前和术后不同时间(术后3天、7天、2周、3周、1月、2月、3月以上)外周血标本。怀疑排斥的患者及时进行肾活检明确诊断,并于冲击治疗前、排斥反应发生后3天、7天、2周、3周以上分别收集标本。采用Real-Time荧光定量PCR、流式细胞术和ELISA等方法动态检测移植受者外周血淋巴细胞HLA-G转录和蛋白水平以及血浆可溶性HLA-G表达的变化规律,对比分析稳定组和排斥组的差异,探讨HLA-G对于移植排斥反应的诊断价值、最佳检测方法。结果: 1、小鼠皮肤移植模型术后移植物的大体改变级组织病理学变化自身移植和同系移植组小鼠移植皮片呈现免疫耐受状态,移植物缝合部位逐渐愈合,皮片红润柔软,毛发重新生长。两种鼠系交叉移植后,受体小鼠移植物呈现明显的排斥反应。C57和BA小鼠皮肤移植物肉眼完全排斥的时间分别为9±0.38天和10±0.24天。用药情况下,C57和BA两种鼠系移植物的存活时间均明显延长,分别为17±0.54天和18±0.36天。两种鼠系移植皮片存活时间没有明显差异。取移植小鼠皮肤移植物进行组织学观察并进行病理分级,结果显示:同系移植皮片与正常皮肤组织差别不明显,异系移植皮片淋巴细胞浸润随术后时间的延长呈现不断增强的趋势,最终导致移植物坏死脱落。按照淋巴细胞浸润和皮肤组织坏死程度将排斥反应分为轻度(Ⅰ级)、中度(Ⅱ级)、重度(Ⅲ级)和严重排斥(Ⅳ级)四个等级。不用药情况下,病理Ⅰ-Ⅳ级排斥反应分别发生于术后2-4天、5-7天、8-10天和11-观察结束。用药情况下,淋巴细胞浸润出现明显延缓趋势,病理排斥Ⅰ-Ⅳ级分别发生于2-8天、9-12天、13-18天、19天-观察结束。而且移植皮片的病理改变没有鼠系特异性。 2、不用药情况下,急性排斥反应发生过程中小鼠Qa-2表达的变化规律同系移植术后,皮肤移植物、外周血Qa-2的表达均基本稳定,与术前保持一致,而异系移植组Qa-2的表达则随着术后时间的不同而呈现不同的变化。皮肤移植物免疫组化检测结果显示:正常和同系移植皮片呈Qa-2阴性表达,仅在皮脂腺细胞呈弱阳性表达。排斥反应发生时,移植物表达变化不大。浸润淋巴细胞呈阴性表达。 Real-Time荧光定量PCR检测结果显示:异系移植组术后5天至术后9天左右Qa-2转录水平有所下调,但与同系移植同一时间点相比没有明显差异。与皮肤排斥反应病理分级结合分析发现,Ⅱ、Ⅲ级排斥反应发生阶段,Qa-2转录总体水平低于同系移植组。流式细胞检测结果显示:异系移植术后4-5天开始,CD4~+T淋巴细胞Qa-2的平均荧光强度(MFI)以及CD8~+T淋巴细胞Qa-2的阳性表达率均明显下降,直到术后第10天才恢复到术前或正常水平,之后甚至高于正常水平或同一时间点的同系移植组。与病理排斥反应分级结合分析,差异更加明显。 ELISA检测血浆sQa-2水平与外周血淋巴细胞Qa-2变化趋势不同。同系移植组术后第2天,sQa-2水平高于正常水平,差异显著,之后恢复正常;异系移植术后2-3天迅速上升并达到峰值,之后下降,术后7天之后基本恢复到术前水平。 BA小鼠PBLs Qa-2的表达明显低于C57小鼠,但变化趋势相似。 3、用药情况下,急性排斥反应发生过程中小鼠Qa-2表达的变化规律皮肤移植物免疫组化检测结果:同系移植小鼠移植皮片呈明显阳性表达。异系移植术后早期,与不用药组相比,Qa-2表达明显增强,皮肤组织细胞和少量浸润淋巴细胞均呈强阳性表达。随着排斥反应的加重,皮肤移植物的阳性表达没有明显改变,但浸润淋巴细胞阳性表达率和表达强度均明显下降。当皮肤发生重度排斥反应时,浸润淋巴细胞Qa-2表达为阴性。排斥反应为Ⅳ级时,由于组织和大量淋巴细胞坏死,无法检测其Qa-2的表达情况,但深层皮肤结缔组织和浸润淋巴细胞均呈阳性表达。 Real-Time荧光定量PCR结果显示:同系移植组术后Qa-2的转录水平虽仍保持基本稳定,但明显高于未用药组。而异系移植组术后早期和末期与同系移植组相同时间没有明显差异,但当排斥反应进展为Ⅱ、Ⅲ级,Qa-2的转录明显下降,甚至达到正常未用药水平。流式细胞检测结果显示:CD4~+T淋巴细胞Qa-2表达的MFI以及CD8~+T淋巴细胞Qa-2的阳性表达率的变化趋势与PBLs Qa-2转录水平的变化基本一致。 ELISA检测血浆sQa-2水平结果显示:用药组术前水平明显低于未用药组。同系移植术后变化不明显。异系移植术后2-6天,sQa-2水平持续上升,但仍明显低于未用药组。术后第7天开始逐渐下降,到术后14天之后,恢复到术前水平。 4、免疫抑制剂种类和剂量对小鼠Qa-2表达的影响连续用药7天以后,小鼠CsA血药浓度达到稳态,并与用药剂量呈明显正相关。免疫移植剂对PBLs Qa-2转录水平的影响:小剂量CsA、Horm和MMF组Qa-2转录水平与正常组没有明显差异。随着剂量的加大,Qa-2转录水平明显升高,CsA在中高剂量效果最为明显;随着剂量的增加,糖皮质激素对Qa-2的上调作用逐渐显著,有明显的剂量相关性,而且明显强于环孢素:与其他两种药物相比,MMF的作用相对较弱。值得注意的是,在所有用药组中,中等剂量混合用药对Qa-2转录水平的上调作用最为显著。免疫移植剂对PBLs亚群Qa-2膜蛋白表达的影响:对于CD4~*T淋巴细胞Qa-2MFI的影响,小剂量CsA即有明显的上调作用,中等剂量作用最为显著。小剂量激素和MMF组与正常组没有明显差异,但较高剂量激素和MMF对CD4~+T淋巴细胞Qa-2 MFI有明显的上调作用,并分别于中等剂量和中高剂量达到最大作用。与转录水平类似,中等剂量混合用药对Qa-2转录水平的上调作用较其他单一用药组更为显著。免疫抑制剂对于CD8~+T淋巴细胞Qa-2的阳性表达率的影响明显较弱。小剂量激素和中等以下剂量CsA和MMF均没有明显调节作用。随着剂量增大,MMF和CsA的上调作用逐渐增强。联合用药作用比较明显。 5、临床肾移植患者术前、术后不同时间HLA-G表达的变化规律稳定组: 外周血单个核细胞HLA-G转录水平于术后3天明显低于术前水平。术后1周后上升到术前水平,并于术后1月左右达到高峰。之后下降,但术后2月和3个月以上的检测结果显示HLA-G转录水平仍明显高于术前。外周血淋巴细胞HLA-G膜蛋白表达总体较低。正常情况CD4~+T淋巴细胞HLA-G阳性表达率只有2.269±0.71896。术后一周内淋巴细胞基本检测不到HLA-G膜蛋白的表达。术后2周后,CD~4T淋巴细胞HLA-G表达明显增强,并逐渐达到高峰(＞14%),术后2月仍然明显高于正常水平。与FK506血药浓度和临床药物剂量结合分析发现CD4~+T细胞HLA-G表达与免疫抑制剂的用量明显相关。不论是术前还是术后不同时期,CD8~+T淋巴细胞HLA-G膜蛋白表达均处于极低水平,基本建成不到阳性表达细胞。血浆可溶性HLA-G的表达术后一周内也明显低于正常水平,但术后2周之后,明显升高并保持较高水平。排斥组:排斥发生当天和随后3天,HLA-G表达明显低于排斥前最后一次随访检测的水平(膜结合型和可溶性)。但一周之后,升高明显。直到术后三周到2月后,HLA-G表达保持较高水平,明显高于术前。与转录水平和可溶性HLA-G检测结果相比,CD4~+T细胞HLA-G表达的变化趋势更为明显,而且操作简单、误差较小。反复发生排斥反应的患者CD4~+T细胞HLA-G表达始终处于较低的表达水平,加大免疫抑制剂药物剂量对HLA-G的表达影响较小。结论: 1、通过动态监测移植术后不同时间小鼠Qa-2的表达变化规律,首次发现:移植术后早期,尤其是在用药状态下,移植物浸润淋巴细胞、外周血淋巴细胞Qa-2表达水平明显下调,发生于淋巴细胞活化的阶段。这一阶段尚未造成严重的移植物损伤,远远早于肉眼排斥的发生。 2、免疫抑制剂可明显提高移植物、浸润淋巴细胞、外周血淋巴细胞HLA-G的表达,同时延长移植物存活时间,但过高剂量作用反而有所下降。免疫抑制剂中等剂量联合应用不但可以达到最大限度上调HLA-G表达的作用,而且对动物的毒性较小,是最佳选择。 3、临床检测结果显示:肾移植术后外周血HLA-G的表达,尤其是CD4~+T细胞HLA-G的动态改变,与免疫抑制剂用药时间和剂量密切相关,并在排斥反应发生时明显下调,有可能成为一种反映移植患者免疫耐受状态和诊断排斥反应发生的无创性检测指标。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R617;R392.1

【参考文献】