问号钩端螺旋体粘附侵袭相关基因mce功能鉴定

发布时间：2018-01-11 08:32

  本文关键词：问号钩端螺旋体粘附侵袭相关基因mce功能鉴定　出处：《浙江大学》2010年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】： 背景和目的:钩端螺旋体(简称钩体)病是全世界范围内流行的,由致病性钩体感染引起的人兽共患传染病。据估计,全世界每年有超过500,000的钩端螺旋体感染病例,死亡率达5～20%。钩体病的致病机制至今未明是对钩体病加以有效控制的主要障碍。钩体可分为致病性的问号钩体和非致病的腐生性双曲钩体,前者感染人或动物后可引起钩端螺旋体病。黏附入侵巨噬细胞是致病性钩体的主要特性之一。问号钩体强大的侵袭力使其能迅速穿越人、动物皮肤或黏膜侵入血流引起钩体血症,故问号钩体的粘附侵袭力与其致病性密切相关,但其分子机制不明。虽然有文献报道问号钩体可以粘附侵入小鼠单核巨噬样细胞(J774A.1),并且推测mce基因可能与问号钩体粘附侵入巨噬细胞相关,然而mce基因的功能至今仍未得到证实。本研究旨在确定各问号钩体菌株携带粘附侵袭相关基因mce的情况,了解问号钩体感染细胞前后mce基因转录水平的变化。通过原核表达rMce并制备其抗血清,分析兔抗rMce血清是否能够抑制问号钩体的粘附小鼠单核巨噬样细胞(J774A.1)。并通过同源重组的方法构建问号钩体mce缺失突变株,在细胞模型中进一步证实问号钩体mce基因是否具有粘附侵袭功能。 实验方法:采用PCR扩增我国15群15型问号钩体参考标准株和2株双曲钩体全长mce基因片段,T-A克隆后测序。采用基因工程技术构建问号钩体赖株mce基因原核表达系统。SDS-PAGE联合Bio-Rad凝胶图象分析系统检查目的重组蛋白rMce表达情况。通过Ni-NTA亲和层析法提纯表达的目的重组蛋白。采用皮内多点注射免疫法制备兔抗rMce血清并通过Western Blot对表达的rMce进行鉴定。采用实时荧光定量RT-PCR法检测问号钩体赖株感染小鼠单核巨噬样细胞后,mce基因在不同时间点转录水平上的变化。通过同源重组,将问号钩体赖株mce基因靶向敲除。采用细胞模型,通过Fontana银染法、双荧光染色法,分析兔抗rMce血清对问号钩体粘附宿主细胞的阻断作用以及问号钩体赖株mce基因缺失突变株粘附和侵袭小鼠单核巨噬样细胞能力的变化。 结果:我国15株问号钩体株均携带mce基因,双曲钩体则否。与报道的问号钩体赖株mce基因序列(GenBank accession No.:NP_712236)比较,所克隆的各菌株mce基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为99.0%～100%和97.9%～100%。所构建的mce基因原核表达系统能表达rMce,其产量约为细菌总蛋白的5%。问号钩体赖株全菌兔抗血清和兔抗rMce血清均能有效识别rMce并阻断问号钩体粘附J774A.1细胞。问号钩体赖株感染小鼠单核巨噬样细胞30、60、90、120分钟后,mce基因转录水平最高上调6.10倍(P＜0.05)。通过同源重组成功构建了问号钩体赖株的mce基因缺失突变株。Fontana银染法和荧光分光光度法检测结果显示,问号钩体赖株mce基因缺失突变株对小鼠单核巨噬样细胞的黏附能力和侵袭能力比野生株分别降低了59.8%和72.7%(P＜0.05)。 结论:mce基因仅存在于致病性的问号钩体中,mce基因产物是序列保守的外膜蛋白。所构建的mce基因原核表达系统能很好地表达rMce蛋白,所制备的rMce抗血清能有效阻断问号钩体粘附宿主细胞。问号钩体感染小鼠单核巨噬样细胞后,mce基因转录水平呈细胞接触上调模式。问号钩体赖株mce基因缺失突变株对小鼠单核巨噬样细胞的黏附能力和侵袭能力与野生株相比下降明显,表明该基因与问号钩体致病性密切相关。
[Abstract]:BACKGROUND & OBJECTIVE : The disease of leptospirosis is epidemic in the world . It is estimated that there are more than 500,000 leptospirosis cases in the world , and the mortality rate is 5 锝，

本文编号：1408861