TLR4促进肿瘤细胞免疫逃逸和凋亡抵抗的分子机制研究

发布时间：2018-01-11 09:41

本文关键词：TLR4促进肿瘤细胞免疫逃逸和凋亡抵抗的分子机制研究　出处：《浙江大学》2008年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 临床与流行病学调查研究发现慢性感染和炎症紊乱与肿瘤发生有关,其中慢性炎症促进肿瘤免疫逃逸,被认为是导致肿瘤发生和发展的重要原因之一。近年来肿瘤细胞表面表达的Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)与肿瘤免疫逃逸的关系倍受关注。研究证明,在慢性感染或炎症条件下,TLR4诱导肿瘤细胞生成大量的免疫抑制性因子抑制免疫细胞启动免疫应答,同时局部感染细胞大量增殖并抵抗凋亡促进细胞存活。因此打破肿瘤免疫逃逸可能成为预防和治疗肿瘤的重要手段。雷帕霉素(Rapamycin)是一种广泛用于治疗自身免疫和移植排斥疾病的免疫抑制剂,最近几年用于治疗肿瘤、抑制血管形成并促进肿瘤细胞凋亡。因此,我们提出Rapamycin这种抗炎药物是否能够阻断TLR4介导肿瘤免疫逃逸,从而起到抗肿瘤的效应。研究结果发现,人HT29和鼠CT26结肠癌细胞组成性地表达较高水平的TLR4,提示TLR4信号可能促进结肠癌细胞免疫逃逸。首先我们用RT-PCR方法检测TLR4信号对免疫抑制因子表达谱的影响,结果显示,LPS刺激后,LPS上调CT26细胞中IL-6和COX-2的表达,随后证明LPS刺激能够促进IL-6和PGE2的合成,这些因子不仅抑制免疫细胞功能而且能够促进肿瘤转移、浸润和存活。然后,我们研究了Rapamycin这种抗炎药物是否能够抑制TLR4介导结肠癌细胞IL-6和PGE2的生成。RT-PCR和ELISA检测都证实,在Rapamycin存在情况下,TLR4-介导的IL-6和COX-2表达以及IL-6和PGE2合成均显著降低,提示Rapamycin能够显著抑制TLR4介导免疫抑制介质的生成。由于IL-6和PGE2是非常重要的调节多种细胞增殖、凋亡、迁移和浸润的分子,因此,我们进一步研究是否LPS能够通过IL-6和PGE2自分泌促进细胞转移和浸润,以及是否Rapamycin抑制了LPS诱导IL-6和PGE2的产生,从而降低CT26细胞的活力。为了证实这一推断,我们在下层小室分别加入重组鼠IL-6或PGE2,发现外源性的IL-6和PGE2能够逆转Rapamycin对CT26细胞迁移和浸润的抑制效应,而且,同时加入IL-6和PGE2时,几乎全部恢复Rapamycin的上述抑制效应。结果表明,Rapamycin能够抑制LPS诱导结肠癌细胞的迁移和浸润,因而,在临床治疗时,Rapamycin可能通过抑制结肠癌细胞分泌IL-6和PGE2而发挥抑制结肠癌转移的抗肿瘤效应。我们先前的实验发现,TLR4能够诱导人肺癌细胞的凋亡抵抗,那么Rapamycin是否能够逆转LPS诱导结肠癌的凋亡抵抗效应呢?Annixin V/PI分析表明,LPS能够降低OXL或DXR所诱导人HT29和鼠CT26结肠癌细胞的凋亡效应,进一步研究发现,Rapamycin能够逆转TLR4所介导的这一凋亡抵抗,表明Rapamycin能够增强肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性,表现出抗肿瘤效应。 Rapamycin抑制TLR4信号促进CT26结肠癌细胞IL-6、PGE2分泌并降低LPS诱导的凋亡抵抗。那么,其可能的分子信号机制如何呢?首先我们利用FACS对TLR4受体膜表面的表达进行分析,发现Rapamycin能够抑制TLR4在细胞膜上的表达,但对TLR4的转录水平没有影响,提示Rapamycin可能通过转录后调节如抑制TLR4的糖基化或向胞膜的转运过程而降低膜表面的表达,Rapamycin介导TLR4的下调可能削弱了LPS所诱导肿瘤的免疫逃逸。随后我们对TLR4介导的MAPKs、Akt和NF-κB信号途径进行了研究。结果发现,在CT26细胞中,Rapamycin对LPS诱导的MAPKs激酶p38、ERK1/2、JNK1/2的活化没有影响,但显著抑制了Akt的磷酸化及NF-κB信号途径。提示Rapamycin可能通过抑制这两条信号通路从而抑制IL-6和PGE2的合成及凋亡抵抗逆转。为了证实这一点,Akt和NF-κB信号分子特异性的抑制剂LY209400及PDTC处理阻断信号后,ELISA检测免疫抑制性因子的生成,结果显示与Rapamycin相似,LY209400及PDTC均能有效抑制IL-6和PGE2的分泌;同样地,LY209400及PDTC均能有效逆转LPS对肿瘤药物OXL和DXR的抵抗作用。可推断Rapamycin作用于Akt和NF-κB信号分子抑制TLR4介导的CT26分泌IL-6和PGE2及OXL和DXR诱导的凋亡抵抗。以上研究结果显示,Rapamycin作用于Akt和NF-κB信号分子打破肿瘤细胞的免疫逃逸,Rapamycin是PI3K/Akt通路有效的抑制剂,但对于NF-κB抑制机制还不清楚。众所周知,I-κB的磷酸化及降解促进NF-κB的核转位。I-κB上游的激酶为IKKα/β,IKKα/β是Akt的调节靶分子,这些通路参与对外界的炎症应答。我们发现LY209400(Akt的抑制剂)与Rapamycin一样均能够抑制IKKα/β和NF-κB的活化,说明Rapamycin通过抑制LPS诱导的Akt/IKKα/β/NF-κB的级联信号抑制结肠癌细胞免疫逃逸和转移。综上所述,Rapamycin能够降低结肠癌TLR4膜表面的表达和抑制Akt/IKKα/β/NF-κB级联通路,从而抑制了TLR4介导的结肠癌细胞自分泌IL-6和PGE2及其所诱导的肿瘤迁移和浸润,并逆转了TLR4所介导结肠癌细胞凋亡抵抗。本实验结果从新的角度解释了Rapamycin通过抑制参与免疫逃逸的因子的形成及增强抗肿瘤药物敏感性从而打破免疫逃逸以发挥抗肿瘤效应,进一步提示了Rapamycin可用于结肠癌的治疗。目前,肿瘤治疗主要依赖于手术、放疗和化疗,然而,临床观察发现,在某些情况下,放化疗可以促进肝癌发展,然而其内在机制依然不明。因此,为了提高治疗效果,探究在治疗过程中HCC的生物学功能及肿瘤恶化机制尤为重要。本文所研究旨在探讨在放疗或生物治疗过程中,肝癌的免疫逃逸和发展机制。诸多研究表明,肿瘤微环境中,持续的炎症刺激和慢性感染导致或促进肿瘤发生、发展。近年来发现,表达于肿瘤中的TLR4受体通过诱导肿瘤细胞释放免疫抑制性的因子和凋亡抵抗从而介导免疫逃逸。高频率重组蛋白-1(High-mobility group box-1,HMGB1)最初被鉴定为DNA体细胞转录调控协同因子。免疫刺激时,炎症细胞和免疫细胞被活化导致HMGB1被包装到溶酶体然后释放到胞外环境;坏死或受损的体细胞以被动的方式释放HMGB1。一旦释放到胞外,HMGB1发挥致炎因子作用活化内皮细胞,促进血管形成,炎症细胞和干细胞向血管外的迁移,通过活化一系列关键信号途径从而启动炎症反应,调节细胞的活化、生长及死亡。因此,HMGB1涉及到多种疾病,包括帕会森、脓血症、缺血再灌注及自身免疫疾病。HMGB1到胞外环境且与肿瘤增殖和转移有关。最近研究表明,HMGB1与肿瘤增殖和转移有关,而且,HMGB1是TLR4的内源性配体,因此,我们研究了在放疗和生物治疗过程中由坏死细胞释放的HMGB1是否能够作为一个旁分泌因子促进肝癌的发展。我们研究发现,在放疗和TRAIL治疗过程中,源于死亡的肝癌细胞株SMMC-7721上清能够诱导SMMC-7721细胞表达免疫抑制性细胞因子VEGF和趋化因子MIP-3α、IP-10和MCP-1。为了确定是否死亡细胞释放的HMGB1诱导了这种炎症效应,我们干扰了SMMC-7221细胞HMGB1,结果发现,HMGB1干扰的坏死细胞的上清对MIP-3α的诱导能力显著减弱,证实了死亡细胞释放HMGB1并将信号传递于其周边细胞。重组的HMGB1也能促进高水平MIP-3α的表达,进一步表明了上清中的HMGB1促进了免疫抑制性细胞因子和趋化因子的表达。为了明确HMGB1是由凋亡细胞还是坏死细胞释放HMGB1,利用放射和TRAIL处理SMMC-7721,Annixin V/PI凋亡检测表明,是死亡细胞而非凋亡细胞释放的HMGB1促进肿瘤细胞的免疫逃逸,因为源于死亡细胞的上清能够促进SMMC-7721表达,但凋亡细胞上清不能诱导其表达。这些研究结果表明,在放疗和TRAIL治疗过程中,死亡肝癌细胞上清中所含的HMGB1促进了免疫抑制过程。由于HMGB1能够介导神经节瘤的生长和扩散,所以我们研究了HMGB1和死亡细胞上清是否能够促进肝癌细胞增殖。MTT检测发现,HMGB1能够促进SMMC-7721增殖,BrdU参入法检测细胞增殖进一步证实死亡细胞上清和HMGB1能够促进肝癌细胞生长。然后,我们研究了是否HMGB1通过加速细胞周期进程从而促进肝癌细胞增殖。细胞周期分析表明,重组HMGB1加速G1向S期的转化,从而促进肝癌细胞的生长。这些实验结果提示,由于放疗和化疗诱导死亡细胞可能通过释放高水平HMGB1加速细胞周期进程从而促进肿瘤的生长和恶化。由于细胞周期素A,D和E是G1向S相转化所必需分子,然后利用蛋白印记方法检测是否HMGB1影响细胞周期素A,D,E的表达,我们发现,HMGB1刺激SMMC-7721后,细胞周期素cyclinD的表达显著增加,但对细胞周期素A和E的表达没有影响。另外,因为p53、p21和p27都是负调节细胞周期进程的分子,因此我们推测可能这些分子在这一过程中发挥重要作用。Western blot显示HMGB1显著下调p27的表达,但不影响p21和p53的表达。因为只有p27在T187位点的磷酸化能被泛素化并被蛋白酶体识别,因此我们检测了是否HMGB1影响p27的磷酸化。Western blot表明,HMGB1刺激后,SMMC-7721细胞中p27—T187磷酸化显著增加。综合以上结果,提示下调p27及增强cyclinD可能是HMGB1加速肝癌细胞周期进程从而促进肝癌细胞增殖和生长的机制之一。在治疗肿瘤的过程中,最主要的瓶颈之一是对抗肿瘤药物的耐受从而不能杀伤肿瘤。我们推测HMGB1可能参与肿瘤的抗凋亡效应。SMMC-7721细胞用HMGB1预处理,然后TRAIL再行行刺激,Annixin V/PI分析发现,HMGB1降低了TRAIL所诱导SKMC-7721的凋亡。为了进一步阐明HMGB1导致凋亡抵抗效应的机制,用蛋白印迹检测了促调亡和抗凋亡蛋白,我们发现,HMGB1刺激SMMC-7721后,抗凋亡蛋白Bcl-xL显著上调,但Bcl-2、Bax或Bak没有变化。这些结果提示,HMGB1诱导Bcl-xL表达很可能是其促进肝癌细胞逃避TRAIL诱导的凋亡从而促进肝癌细胞存活的机制之一。如前面所述,重组HMGB1和源于死亡细胞的上清能够促进肝癌SMMC-7721细胞免疫抑制细胞因子VEGF和趋化因子MIP-3α,IP-10和MCP-1的表达。另外,HMGB1是TLR4内源性配体,因而,为了进一步证实HMGB1是否通过TLR4/MyD88信号途径而介导免疫逃逸的诱导,我们构建了针对于SMMC-7721细胞TLR4和MyD88的干扰载体。RT-PCR检测表明,HMGB1或死亡细胞上清处理TLR4或MyD88缺陷的SMMC-7721细胞后,对MIP-3αmRNA诱导表达能力显著降低,说明重组的HMGB1和死亡细胞的上清介导MIP-3α表达依赖于TLR4/MyD88信号途径。另外,与LPS刺激相似,HMGB1能够活化SMMC-7721细胞p38MAPK、ERK1/2、JNK和NF-κB信号通路。因此,我们研究了HMGB1是否通过MAPK或NF-κB参与细胞周期和凋亡抵抗的调节。Western blot检测表明MEK1/2(PD98059)和ERK1/2(U0126)抑制剂能够显著抑制HMGB1诱导的SMMC-7721细胞p27磷酸化及其降解以及周期素D1的表达。而NF-κB抑制剂PDTC下调HMGB1所诱导的抗凋亡蛋白Bcl-xL的表达。因此,HMGB1/TLR4诱导的肝癌细胞周期转化是由MEK1/2/ERK1/2信号通路介导,而N-κB是促进HMGB1诱导肝癌细胞凋亡抵抗的关键信号分子。因此,HMGB1/TLR4信号介导肝癌细胞凋亡抵抗和加速细胞周期转化过程,从而促进肝癌免疫逃逸和进一步发展。综上所述,由30 Gy-co-ray放疗或TRAIL处理所导致死亡的肝癌细胞的分泌上清能够反馈性地诱导肝癌细胞表达免疫抑制细胞因子VEGF和趋化因子MIP-3α、IP-10和MCP-1,死亡的人肝细胞癌细胞释放的HMGB1介导了此种效应。HMGB1通过增强cyclinD表达及p27-T187磷酸化和降解而促进了肝癌细胞G1—S期的进程。另外,HMGB1可通过上调抗凋亡蛋白Bcl-xL而增强肝癌细胞对TRAIL诱导凋亡的抵抗,提示,放化疗导致死亡的肝癌细胞释放的HMGB1参与了肿瘤的逃避免疫和凋亡抵抗。干扰HMGB1或TLR4/MyD88之后,死亡的肝癌细胞以及重组HMGB1均不能有效诱导肝癌细胞表达MIP-3α,进一步证实了HMGB1/TLR4/MyD88途径依赖的放化疗促进肝癌的免疫逃逸作用。因此,我们研究结果提供的实验结果直接证明了在放化疗过程中坏死的肝癌细胞能够通过释放HMGB1并通过TLR4/MyD88依赖途径介导了肝癌免疫逃逸和凋亡抵抗,提示通过中和或干扰肝癌细胞中HMGB1并与化疗联合应用可能有助于肝癌的治疗。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R392;R730.2

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