人MBL-MASPs复合物及人血清白蛋白单克隆抗体的制备、鉴定与初步应用

发布时间：2018-01-12 05:02

本文关键词：人MBL-MASPs复合物及人血清白蛋白单克隆抗体的制备、鉴定与初步应用　出处：《南方医科大学》2010年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： MBL-MASPs复合物(MBL-MASPs complexes)由甘露聚糖结合凝集素(mannan-binding lectin, MBL)和甘露聚糖结合凝集素相关的丝氨酸蛋白酶(MBL-associated serine proteases, MASPs)两类蛋白分子结合构成。MBL为C型凝集素超家族中胶凝素(collectins)家族成员,是天然免疫系统中一种重要的模式识别受体。MASPs与补体Cls、C1r同属丝氨酸蛋白酶亚家族,目前已确认的MASP家族成员包括3个丝氨酸蛋白酶(MASP-1、MASP-2、MASP-3)和1个非酶蛋白(sMAP),均可与MBL形成复合体。人血清中MBL含量很低,正常人平均含量水平约1.0mg/L,且与MASPs以一种大分子复合物的形式存在,因此获取高纯度的MBL-MASPs复合物、MBL及MASPs蛋白存在困难。血循环中的MBL-MASPs复合物有多种,但具体种类、化学计量关系、复合物形成的调节机制等问题仍不清楚。 MBL可选择性识别多种病原体的糖结构,通过激活MASP-1、MASP-2和MASP-3进一步激活补体凝集素途径而发挥溶破和间接调理功能,并能与吞噬细胞胶凝素受体(即ClqR)结合而启动调理吞噬,还可介导MBL依赖的细胞毒作用,同时MBL还是一个重要的粘膜表面防御分子。血清MBL缺陷及活性降低可导致调理吞噬作用缺损,表现为各种病原体的反复急慢性感染。MBL基因突变还与自身免疫病密切相关,甚至HBV、HIV等特殊病原体的感染及其发展转归也与MBL缺损有关。MASP-2缺陷主要由遗传多态性引起,其对感染性疾病易感性的影响目前还知之甚少。有报道MASP-2缺陷是化疗后感染的危险因素,肾癌患者尿液中sMAP的含量高于健康人。由于MBL和MASPs具有上述重要作用,研究其缺损的发病机理尤为迫切,而MBL-MASPs复合物单克隆抗体(单抗)便是进行该项研究的重要工具之一。目前国内虽然已有关于制备MBL单抗的报道,但仍无国产商品化试剂,国外相关试剂价格昂贵,因此,自制MBL-MASPs单抗非常必要。本课题的特色与创新之处在于：从一个单抗制备过程中,获得针对MBL-MASPs复合物及其各组成成分MBL、MASP1、MASP2以及其不同表位的众多目的单抗。由于MBL-MASPs复合物中成分复杂,因此本课题的难点在于如何对获得的各种单抗进行特异性鉴定,从目前条件出发,我们初步的解决办法是使用ELISA、Western blotting、MBL功能阻断试验并结合各成分分子量进行综合分析。在MBL-MASPs复合物单抗制备、鉴定过程中,我们得到两株人血清白蛋白(Human serum albumin, HSA)单抗,证明用来免疫小鼠的MBL-MASPs复合物抗原中含有微量HSA。HSA是血液系统的重要组分,具有结合和运输内源性及外源性物质,维持血液胶体渗透压,清除自由基,抑制血小板功能及影响动脉血管渗透性等生理作用。临床上高纯度的HSA作为血浆容量扩充剂广泛应用于大出血、休克、烧伤、癌症、红白细胞增多症、白蛋白过少症等。另外,微量白蛋白尿是糖尿病肾病最早的临床表现,是心血管疾病发病率和死亡率显著增高的一个标志,而早期监测尿微量白蛋白水平能够使个体化的积极治疗及早实施,达到预防或延缓糖尿病肾病向终末期肾病进展的目的。鉴于上述HSA的作用和性质,为了建立灵敏、快速、准确的微量白蛋白检测方法及HSA提纯方法,同时也为了进一步纯化MBL-MASPs复合物抗原,使关于MBL-MASPs复合物功能性质的研究结果更可信,我们决定应用杂交瘤技术制备HSA单克隆抗体作为必要的工具。第一章：MBL-MASPs复合物单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用为了研究MBL和MASPs的功能特性及其缺损时的发病机理,我们以MBL-MASPs复合物为抗原制备单克隆抗体,希望能够得到针对MBL-MASPs复合物及其各组成成分MBL、MASP1、MASP2、MASP3、sMAP以及其不同表位的众多目的单抗,尤其是针对MBL与MASPs结合位点或二者结合后两蛋白之间空间结构的单抗。我们采用杂交瘤技术,通过多次细胞融合及克隆化并用HSA作为抗原进行差减筛选,最终建立能分泌特异性单抗的杂交瘤细胞株。采用ELISA、Western blotting结合MBL-MASPs复合物及其各组成成分分子量进行特异性鉴定分析,并通过检测所得单抗对MBL功能的阻断作用进一步证明其特异性。结果总计获得22株可能分泌MBL-MASPs复合物单抗的杂交瘤细胞,经抗体亚类(型)鉴定,其中10株为IgM亚类,其余12株为IgG亚类。对于IgM亚类单抗,我们只用间接ELISA法进行了初步鉴定,而对IgG亚类单抗则进一步用了Western blotting和MBL功能阻断试验做了鉴定。结果表明12株IgG亚类单抗中,有7株可能针对MBL二聚体或MBL(二聚体)-MASP2(单体)；1株针对MBL单链或MBL多聚体；1株针对MBL单体、MBL三聚体(含)以上多聚体；1株针对MBL三聚体,其余两株分别针对MASP1和MASP3。其中5A7杂交株与商品化MBL抗体Western blotting结果相同。我们选取5A7和1C8两株单抗进行了MBL功能阻断试验,发现二者均能抑制MBL对PBMC分泌细胞因子IL-6、IL-2及IFN-γ的刺激作用,由此印证了这两株单抗与MBL结合的特异性。而12株IgG亚类单抗中有无针对MBL与MASPs结合位点或二者结合后两蛋白之间空间结构的单抗还需进一步鉴定。此外,我们还对纯化的MBL-MASPs复合物单抗进行了辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase, HRP)的标记,为以后建立MBL-MASPs复合物及其相关成分的ELISA检测体系做准备。总之,通过使用杂交瘤技术,我们获得了MBL-MASPs复合物的多种单抗并进行了初步鉴定,基本达到了预期目的,为后续的MBL功能特性、缺陷时发病机理以及蛋白分离提纯等研究工作提供了重要工具。第二章：人血清白蛋白单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用为了建立灵敏、快速、准确的HSA定量方法及分离提纯方法并进一步纯化MBL-MASPs复合物抗原,我们应用杂交瘤技术制备HSA单克隆抗体,希望利用HSA单抗建立双抗体夹心ELISA检测体系并制备抗体偶联亲和层析柱。通过细胞融合及克隆化筛选,建立特异性杂交瘤株。采用ELISA、Western blotting进行特异性鉴定分析,通过交叉配对法选择合适的夹心ELISA抗体对,利用棋盘滴定法确定包被抗体和检测抗体的适宜工作浓度,制备HSA单抗与CNBr actived Sepharose 4B偶联的亲和层析柱并鉴定其对HSA和MBL-MASPs复合物的分离纯化效果。结果总计获得20株分泌HSA单抗的杂交瘤细胞,经抗体亚类(型)鉴定均为IgG亚类,所得单抗经辛酸-硫酸铵法纯化后全部用简易过碘酸钠法进行了HRP标记。间接ELISA法和Western blotting对各个单抗特异性鉴定结果良好。我们对其中1C11、2E9、3A5、4H1四株单抗进行了较深入的研究,并初步建立了3A5-2E9和2E9-2E9两个双抗体夹心ELISA检测体系。前者标准曲线为y=0.1764Ln(x)-0.2378,R2=0.9689；后者为y=0.1676Ln(x)-0.2079,R2=0.9663；二者检测范围和灵敏度均相同,分别为16-2000ng/ml和8ng/ml,灵敏度均满足尿微量白蛋白检测要求,但仍有待进一步完善和临床考核。我们用单抗1C11成功制备了抗体偶联亲和层析柱,Western blotting结果表明,该层析柱能够较好地分离提纯人血清和MBL-MASPs复合物中所含的HSA,换言之,能够去除MBL-MASPs复合物中的HSA杂质,但去除杂质后MBL-MASPs复合物的功能活性尚有待进一步鉴定。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R392

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