人呼吸道合胞病毒（HRSV）低温传代株稳定性的研究

发布时间：2018-01-12 07:32

  本文关键词：人呼吸道合胞病毒（HRSV）低温传代株稳定性的研究　出处：《中国协和医科大学》2009年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】： 本研究课题目的是分析HRSV A_2株经低温培养传代后毒力改变的情况及稳定性检测,为疫苗的开发做基础研究。实验内容主要包括:HRSV在KMB_(17)上于32℃连续传代、低温传代株遗传稳定性检测、在不同温度及物理条件下HRSV稳定性的观察及核酸荧光染色法观察HRSV合胞现象。 HRSV在KMB_(17)上于32℃连续传代已至35代,病毒培养增殖时间在7-10天左右,感染性滴度在7.0-7.5 lgCCID_(50)/ml之间,表明HRSV已慢慢适应KMB_(17)细胞,为培养细胞基质的更换(使用二倍体细胞培养病毒)及减毒株的筛选奠定良好基础。 遗传稳定性观察包括:一步生长曲线、免疫原性及核酸序列检测。本实验对低温培养的第5、19、28和34代做了一步生长曲线观察,结果表明HRSV在低温下的适应性,即低温传代代次较高的病毒在32℃病变时间越来越短,感染性滴度也越来越高,至34、35代时感染性滴度已稳定在7.5lgCCID_(50)/ml。另外,实验选择经低温培养的第21和26代病毒进行动物实验,检测其免疫原性。结果显示,低温传代的HRSV减毒程度还不够,仍能致靶器官组织产生明显炎症及间质性肺炎;且抗原性不强,诱导机体产生的中和抗体效价约为1:2-1:8。最后实验对低温培养的不同代次病毒进行了G蛋白基因核酸序列测定,通过对低温传代株P15、P20、P25的序列比对,未发现编码G蛋白基因发生变异。 HRSV在不同温度保存及物理条件处理后稳定性观察,结果显示HRSV稳定性较差,在37℃和室温下保存都不稳定,感染性滴度每天分别下降1.0-2.0 lgCCID_(50)/ml和0.2-0.8 lgCCID_(50)/ml;在4℃下感染性滴度下降较慢,存放5周之后,病毒滴度变化＜0.6 lgCCID_(50)/ml,可短暂保存;-20℃保存3个月后滴度仅下降0.5 lgCCID_(50)/ml,为保证感染性滴度稳定HRSV需保存于-20℃或更低温度。HRSV在冻融之后,病毒感染性滴度呈明显下降趋势,每冻融1次,病毒感染性滴度下降约1.30 lgCCID_(50)/ml。经超声波处理后,HRSV病毒感染性滴度下降更快,超声处理2次后,病毒几乎无感染性。 鉴于HRSV稳定性差,实验在病毒液中加入保护剂后观察了滴度下降的情况。结果显示,保护剂对病毒热不稳定性和冻融不稳定性均起到稳定作用。 核酸荧光染色法观察HRSV在几种细胞上的合胞体现象。其中Hep-2细胞是HRSV病变最快的细胞,在培养24h后,可看见合胞现象;Vero细胞病变时间次之,KMB_(17)细胞最慢,且病变形态不同于前两者。可能与病毒对细胞的敏感程度及细胞表面受体类型不同有关。
[Abstract]:The purpose of this study was to analyze the virulence and stability of HRSV Avian 2 strain after subculture at low temperature. The basic research for vaccine development. The main contents of the experiment include: 1. HRSV was subcultured at 32 鈩，

本文编号：1413308