MLCK钙调蛋白结合位点突变体的构建及其对VSMC增殖和迁移的影响

发布时间：2018-01-13 07:14

  本文关键词：MLCK钙调蛋白结合位点突变体的构建及其对VSMC增殖和迁移的影响　出处：《大连医科大学》2014年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：目的：平滑肌在体内分布广泛，其具有多种独特的功能和复杂的调节机制，对维持人体生理功能起重要的调节作用。肌球蛋白轻链激酶（myosin light chainkianse, MLCK）是调节平滑肌收缩的关键酶。一般情况下，当平滑肌细胞受到刺激后，细胞内的Ca2+浓度升高并达到阈值，Ca2+和钙调蛋白（calmodulin, CaM）结合形成Ca2+/CaM复合物，该复合物可以激活MLCK，活化的MLCK可以使肌球蛋白20kDa调节轻链（myosin light chains，MLC20）的第19位丝氨酸磷酸化，进而激活肌球蛋白头部的Mg2+-ATP酶的活性，ATP水解释放能量，促使肌球蛋白与肌动蛋白之间发生相互作用，引起平滑肌的收缩，这是平滑肌收缩的激酶调节机制。MLCK作为一种多功能调节蛋白质，，除具有激酶活性外，还具有与肌动蛋白和肌球蛋白结合的非激酶活性。研究表明，MLCK对细胞增殖、迁移以及细胞骨架的重组也有重要的作用。在生理条件下，平滑肌细胞在Ca2+浓度下降后仍维持一定程度张力，表明MLCK的非激酶作用可能在平滑肌收缩与舒张的调节过程中产生一定影响。以往的体外功能研究显示：当MLCK的第1002-1022位CaM结合位点突变后，MLCK失去了磷酸化MLC20的激酶活性；并且它可以在无Ca2+/CaM条件下降低磷酸化肌球蛋白的Mg2+-ATP酶活性，增加非磷酸化肌球蛋白的Mg2+-ATP酶活性；同时它也可以降低体外肌动蛋白肌丝运动的速度。为了更好地研究MLCK分子的非激酶活性对血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响，本实验拟构建MLCK的CaM结合位点突变真核表达载体。利用牛胃重组全长野生型MLCK，对其第1002-1022位氨基酸（即CaM结合位点）进行定点突变。本实验在牛胃平滑肌MLCK的1002-1022CaM结合位点Trp1006突变为Ala的基础上进行突变，使MLCK的1002-1022CaM结合位点中Arg1018突变为Ala（即AGA突变为GCG）、Leu1019突变为Ala（即CTG中的CT突变为GC），从而构建了牛胃MLCK的1002-1022CaM结合位点突变的真核表达载体（pcDNA3.1-Flag-MLCK-Δ3CaM）。为了研究MLCK的非激酶活性对血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响，将构建的MLCK的1002-1022CaM结合位点突变真核表达载体（pcDNA3.1-Flag-MLCK-Δ3CaM）转染至MLCK基因缺失的豚鼠脑基底动脉血管平滑肌细胞（Gba M-），对比转染前后细胞增殖和迁移的变化。本实验在以往研究的基础上，为探索MLCK的非激酶活性对平滑肌细胞功能的影响，进一步阐明平滑肌收缩的机制提供实验依据。 方法：⑴根据牛胃MLCK cDNA序列设计CaM结合位点突变引物，利用PCR技术进行定点突变，构建CaM结合位点突变的原核表达载体（pColdⅠ-MLCK-Δ3CaM）和真核表达载体（pcDNA3.1-Flag-MLCK-Δ3CaM）。⑵将pcDNA3.1-Flag-MLCK-Δ3CaM转染至Gba M-细胞，用免疫荧光法检测质粒瞬时转染情况。⑶用合适浓度的G418筛选pcDNA3.1-Flag-MLCK-Δ3CaM稳定转染至Gba M-的细胞株。⑷用MTT法检测pcDNA3.1-Flag-MLCK-Δ3CaM转染至Gba M-后细胞增殖情况。⑸用划痕法检测pcDNA3.1-Flag-MLCK-Δ3CaM转染至Gba M-后细胞迁移情况。 结果：⑴针对CaM结合位点设计突变引物，以pColdⅠ-MLCK-Δ1CaM为模板进行PCR，用NcoⅠ单酶切pColdⅠ-MLCK-Δ1CaM质粒和pColdⅠ-MLCK质粒，分别从pColdⅠ-MLCK-Δ1CaM获得556bp突变的目的片段，从pColdⅠ-MLCK获得7.4kb的载体片段，用连接酶将556bp突变目的片段和7.4kb载体片段连接，获得CaM结合位点三点突变的原核表达载体pColdⅠ-MLCK-Δ3CaM，该质粒经测序结果正确。⑵用KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切pColdⅠ-MLCK-Δ3CaM质粒pcDNA3.1-Flag-MLCK真核表达质粒，分别从pColdⅠ-MLCK-Δ3CaM获得3.4kb目的片段，从pcDNA3.1-Flag-MLCK获得5.5kb的载体片段，用连接酶将3.4kb目的片段和5.5kb的载体片段连接获得CaM结合位点三点突变的真核表达载体pcDNA3.1-Flag-MLCK-Δ3CaM，该质粒经测序结果正确。⑶用免疫荧光法检测瞬时转染情况，将pcDNA3.1-Flag-MLCK-Δ3CaM转染至Gba M-细胞，发现转染48小时后的Gba M-细胞充分表达MLCK蛋白，转染效率约达80%。⑷利用G418筛选质粒pcDNA3.1-Flag-MLCK-Δ3CaM稳定转染至Gba M-的细胞株，确定了G418对血管平滑肌细胞MLCK基因缺失型Gba SM-4的药物最低致死浓度为500ug/ml。⑸用MTT法检测细胞增殖情况，结果显示：与Gba SM-4细胞（未敲除MLCK）组相比，Gba M-（MLCK敲除）组细胞增殖率明显升高；而分别将pcDNA3.1-Flag-MLCK和pcDNA3.1-Flag-MLCK-Δ3CaM转染到Gba M-后细胞增殖率均明显降低，但二者未见显著差异（p0.05）。⑹用划痕法检测细胞迁移，结果显示：与Gba SM-4组相比，Gba M-组细胞迁移率降低，而分别转染pcDNA3.1-Flag-MLCK和转染pcDNA3.1-Flag-MLCK-Δ3CaM到GbaM-后细胞迁移率均升高,但二者未见明显差异（p0.05）。 结论：⑴成功的构建了MLCK的CaM结合位点突变原核表达载体（pColdⅠ-MLCK-Δ3CaM）和真核表达载体（pcDNA3.1-Flag-MLCK-Δ3CaM）。⑵在血管平滑肌细胞GbaSM-4中MLCK具有抑制细胞增殖的作用，其中MLCK的1002-1022CaM结合位点对细胞增殖的作用不明显。⑶在血管平滑肌细胞GbaSM-4中MLCK能够促进细胞迁移，其中MLCK的1002-1022CaM结合位点对细胞迁移的作用不明显。
[Abstract]:In order to study the effect of MLCK on proliferation and migration of smooth muscle cells , the activity of myosin light chain kinase ( MLCK ) and the activity of myosin light chain kinase ( MLCK ) on the proliferation and migration of smooth muscle cells were studied . Methods : ( 1 ) The eukaryotic expression vector ( pCold 鈪

本文编号：1417968