五谷虫二次免疫后的抗菌物质对金葡菌和大肠杆菌结构影响的实验研究

发布时间：2018-01-13 18:26

  本文关键词：五谷虫二次免疫后的抗菌物质对金葡菌和大肠杆菌结构影响的实验研究　出处：《大连医科大学》2013年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：目的：分离获得二次免疫后的五谷虫抗菌物质，并明确该抗菌物质的抗菌机制。 方法： 1．无菌五谷虫的培育 （1）准备和处理虫卵：把在野外捕获到的丝光绿蝇在无菌的实验室条件下进行饲养，等其产卵后再消毒。 （2）五谷虫的饲养：在保持无菌的环境下，要求每日至少光照时间在12小时以上，空气的湿度为60%，室内温度控制在25～27℃。 （3）五谷虫的消毒：首先放入3.5%甲醛生理盐水中浸泡5min，然后放入2%双氧水中浸泡3min，最后用5%稀盐酸溶液浸泡5min。在每一步处理完之后，都用无菌的重蒸水洗涤3次以上。并且保持经消毒处理之后的五谷虫依然有旺盛的生命活力。 2．细菌的准备 （1）细菌活化：取4℃冷藏保存的大肠杆菌和金葡菌固体斜面，无菌接种环刮取少许菌落接种于20ml液态Luria-Bertani(LB)培养基中，37℃,120r/min培养17h，至菌液混浊，将活化后的大肠杆菌和金葡菌置于4℃冰箱中冷藏保存备用。 （2）细菌的扩大培养：分别取100μl活化后的大肠杆菌和金葡菌菌液加入到10ml液态LB培养基中，37℃,120r/min继续培养4h，再用无菌液态LB培养基稀释大肠杆菌和金葡菌菌液的浓度为108cfu/ml，光密度值（OD）为0.5。 3．五谷虫与大肠杆菌和金黄色葡萄球菌共培养（二次免疫） 分八组每组四条五谷虫，分别与之相对应的菌浓（108-101cfu/ml）共培养6，12，18，24，30，36，42，48小时，选取在最长时间和最大菌浓条件下，生命力最旺盛的一组，然后按此条件大批量共培养。 4．五谷虫粗提物制备 取共培养3龄五谷虫幼虫共计100条，加入2倍体积的TNE缓冲液（5mMEDTA，10mM Tris-HCl,150mM NaCl, pH7.5），并对其进行充分的匀浆，，匀浆液第一次离心(12000r/min,10min，4℃)，取上清液。上清液加3倍体积的TNE缓冲液，沸水水浴2min，再次离心(12000r/min,4℃,10min)，取上清液，即为粗提物。 5．Brandford法测定其蛋白含量 6.多孔板MTT法检测五谷虫提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌增殖的影响： 首先用无菌ddH2O溶解已经筛选出的具有明显的抗菌活性的提取物。将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌用LB培养基培养至其对数生长期，然后用LB培养基稀释菌浓至106cfu/ml，最后在灭菌的96孔板的每个孔中加入菌液90μl。药物组孔分别加进倍比稀释具有明显的抗菌活性的提取物溶液10μl，阴性对照组孔则加入无菌的ddH2O10μl，阳性对照组孔加入10mg/ml的氨苄青霉素10μl，另外设一空白的调零孔，加入90μlTSB培养基和10μl无菌ddH2O，每组分别设4个重复孔。 将96孔板置于培养箱中暗培养24h，每孔加入5mg/ml MTT溶液10μl，继续共培养4h，最后将显色的菌液离心，去上清，加入10%DMSO100μl，终止反应。用全自动酶标测试仪测定600nm的吸光值（OD600），计算抑制率（%）。 7.对质粒复制的影响 在Eppendorf管中各加入5μL质粒和15μL无菌水,然后依次加入各个不同浓度的五谷虫提取液，以不含五谷虫提取液的反应体系作为对照，混匀后,37℃,恒温箱下培养2小时，然后进行琼脂糖凝胶电泳分析，研究五谷虫提取物对质粒DNA的作用特点。 8.对大肠杆菌和金葡菌DNA复制的影响。 采用PCR聚合酶链式反应，模板为指示菌基因组DNA，反应体系中分别加入各种不同浓度的中药五谷虫提取液，以不含五谷虫提取液的反应体系作为对照，进行进行PCR聚合酶链式反应。取反应后的各组的产物做琼脂糖凝胶电泳分析，研究五谷虫提取物对细菌Taq DNA聚合酶活性的影响。 9．观察五谷虫提取物抗菌物质对大肠杆菌和金葡菌超微结构的影响： 收集与MIC浓度五谷虫提取物共培养12h的大肠杆菌和金葡菌，取对数生长期的大肠杆菌和金葡菌作为对照，3000r/min离心10min，收集菌体，无菌生理盐水洗涤后重悬于2.5%戊二醛中固定，常规锇酸固定、浓度梯度乙醇脱水，扫描电镜观察细菌超微结构的变化。 结果： 1.MTT法显示五谷虫提取物能够明显的抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的增殖，且对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的最低抑菌浓度（MIC）为0.5mg/ml。 2.琼脂糖凝胶电泳图示当提取物浓度在10mg/ml时，质粒条带未跑出；提取物浓度在1mg/ml时，质粒条带明显变暗。 3.琼脂糖凝胶电泳图示当加入的提取物浓度在0.5mg/ml以上时，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌DNA经PCR扩增后所得产物通过琼脂糖凝胶电泳未得到电泳条带。 4.扫描电子显微镜示当与0.5mg/ml的五谷虫提取物抗菌物质共培养12h后，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌表面出现凹陷或孔洞甚至破裂。 结论： 1.二次免疫后五谷虫提取物能明显抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的增殖，且其最低抑菌浓度为0.5mg/ml。 2.二次免疫后五谷虫抗菌物质通过抑制大肠杆菌和金葡菌质粒和DNA的复制，以及破坏细菌细胞膜的结构，从而达到抗菌效果。
[Abstract]:Objective: to isolate the antibacterial substances from the two immunized cereals and to clarify the antibacterial mechanism of the antiseptic substance.
Method锛

本文编号：1420024