问号钩端螺旋体鞭毛相关fliN基因靶向敲除及其突变株致病性变化

发布时间：2018-01-14 14:33

  本文关键词：问号钩端螺旋体鞭毛相关fliN基因靶向敲除及其突变株致病性变化　出处：《浙江大学》2010年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】： 背景和目的问号钩端螺旋体(简称钩体)感染引起的钩体病是全球流行的自然疫源性人兽共患传染病,其致病机制至今不明。研究结果显示,不同毒力的问号钩体均能以菌体一端或两端粘附宿主细胞,而此处正是相当于细菌鞭毛基础小体的钩体鞭毛终结结构所在部位。细菌鞭毛基础小体含有Ⅲ型分泌系统,不仅承担细菌分裂后鞭毛生长时鞭毛蛋白的输出,一些与细菌粘附、侵袭和毒性相关因子也通过T3SS释放。问号钩体fliN基因虽被注释为鞭毛马达开关蛋白,但其序列中有与大肠杆菌fliN基因、鼠疫耶尔森菌yscQ基因相似的共同基序Pf:SpoA。大肠杆菌fliN基因属于T3SS,其产物在细菌粘附及侵入细胞过程中有重要作用。YscQ也是耶尔森菌T3SS中与侵袭力相关的毒力蛋白。因此,问号钩体fliN也极有可能具有与大肠杆菌fliN和耶尔森菌YscQ相似的功能。本研究中,我们采用基因敲除技术构建了fliN基因失活的问号钩体突变株,通过比较野生株和突变株动力以及分泌毒性物质、黏附细胞、诱导细胞凋亡能力的差异,对问号钩体fliN基因的致病机制进行了研究。 实验方法构建基因打靶载体p2NIL~(fliN-amp),采用基于自杀质粒与染色体同源序列重组的靶基因敲除技术构建不表达fliN的问号钩体赖型56601株突变株,采用PCR、测序和Western Blot对fliN~-突变株进行鉴定。采用动力试验、MTT、Fontana镀银染色法和流式细胞术,对fliN~-突变株的迁移能力、培养物上清对小鼠单核-巨噬样细胞株J774A.1的细胞毒性、黏附及诱导J774A.1细胞凋亡能力的改变进行研究。 结果PCR、测序和Western blot结果均证实成功构建了fliN~-突变株,该突变株能在含100μg/ml氨苄青霉素的Korthof培养基中生长及繁殖。fliN~-突变株在Korthof半固体培养基上菌落直径(2～3 mm)明显小于野生株(6～8 mn),表明该突变株动力消失。fliN~-突变株培养物上清作用J774A.1细胞72 h时虽显示有细胞毒性,但明显低于野生株(P＜0.05)。fliN~-突变株作用J774A.1细胞60 min时的黏附率(25.5%)明显低于野生株(47.5%),其引起J774A.1细胞坏死和细胞凋亡率(30.6%和22.7%)也明显低于野生株(48.2%和35.2%)(P＜0.05)。 结论fliN~-基因产物与问号钩体黏附细胞、分泌毒力因子和诱导细胞凋亡密切相关。采用基于自杀质粒基因敲除技术可用于研究问号钩体靶基因产物的致病机制。
[Abstract]:Background and objective Leptospirosis caused by Leptospira interrogans (Leptospira) infection is a worldwide epidemic of zoonotic infectious diseases, and its pathogenesis is still unknown. Leptospira with different virulence could adhere to host cells at one or both ends of the cell. This is where the Leptospiral flagellum terminates corresponding to the bacterial flagellum basal body. The bacterial flagellum basal body contains type 鈪，

本文编号：1424010