新生隐球菌格鲁比变种毒力差异基因型菌株之间毒力相关基因的分析研究

发布时间：2018-01-14 21:21

本文关键词：新生隐球菌格鲁比变种毒力差异基因型菌株之间毒力相关基因的分析研究　出处：《贵阳医学院》2014年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的了解新生隐球菌格鲁比变种(Cryptococcus neoformans var. grubii.)两组毒力差异明显的多位点微卫星型(Multilocus Microsatellite Typing, MLMT)菌株间的差异基因,探讨导致新生隐球菌格鲁比变种间毒力差异的相关基因及这些基因的功能。方法1、采用多位点序列分型(Multilocus Sequence Typing, MLST)技术分析分离自环境和临床各10株新生隐球菌格鲁比变种的基因型,并鉴定实验菌株交配型,与之前实验中的微卫星分型结果对比,比较不同基因分型方法的分类多样性。2、根据已有基因组数据,针对可能为新生隐球菌毒力相关的基因设计特异性引物,扩增并测序,通过序列对比分析每个基因在两组微卫星基因型菌株间存在的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)位点,并对引起差异的蛋白质进行分析和预测。3、选取毒力差异最为明显的不同基因型菌株各一株进行全基因组重测序,运用比较基因组学方法全面分析测序结果,使用非同义SNPs(non-synonymous SNPs, nsSNPs)、无义突变SNPs、产生移码突变InDels勺策略广泛筛选差异基因。4、对筛选出的基因在所有实验菌株中进行DNA测序验证,并提取总RNA,采用快速扩增5’和3’cDNA末端(rapid amplification of 5'and 3'cDNA ends, RACE)技术,克隆后测序获得对应基因的完整cDNA全长序列信息。5、通过重组PCR技术构建带有诺尔丝菌素抗性标记(nourseothricin-resistant marker, NAT)基因和目的基因侧翼序列的基因敲除盒,利用基因枪直接转化新生隐球菌原始株,筛选和验证获得CNAG_01032基因敲除菌株；从原始株的基因组中扩增CNAG_01032基因及两侧翼共约5.4kb序列,分别酶切后与将带有抗性标记基因NEO的质粒连接,得到pJAF12-01032重组质粒,利用基因枪将重组质粒转化敲除株,经筛选和验证获得CNAG_01032基因重建株。结果1、在微卫星分型中为MLMT-36的10株环境分离株,MLST分型为ST-15,而在微卫星分型中为MLMT-13型的10株临床分离株,MLST分型为ST-32,所有菌株交配型均为MATα;2、在成功测序的11个基因中,除2个基因序列完全相同外,其余9个基因在两组毒力差异明显的基因型菌株间分别存在1-4个规律性SNP,其中,有2个基因中存在nsSNPs,这2个基因的编码产物分别为沉默信息调节因子2家族成员Hst302和UV切除修复蛋白Rad23。另外,在对Rad23蛋白的系统发育分析发现,与真菌界的其他门类相比,在担子菌纲的多数Rad23蛋白与人类的同源基因亲缘关系更近。3、通过全基因组重测序,环境株IFM56731和临床株IFM56800均分别获得覆盖率较高的有效数据。分别对SNPs和InDels数据进行统计分析,应用无义突变SNPs和产生移码突变的InDel分别筛选出3个差异基因。4、对筛选出的6个基因在所有实验菌株中进行扩增测序,并对其中3个基因进行cDNA的测序分析,最终确定基因CNAG_01032的转录序列位置和结构,并验证了预测的无义突变位点存在于实际的mRNA中。5、通过测序证明24个抗诺尔斯菌素阳性转化子中有20个已成功敲除基因CNAG_01032,设定其中1号转化子为CNAG_01032基因缺陷株；通过三组PCR扩增和四组含抗生素培养基的综合筛选,获得成功整合表达载体并稳定遗传的转化子3个,设定3号转化子为CNAG_01032基因重建株。结论1、MLST分型结果与前期实验的MLMT分型结果高度一致,提示以上两种分子分型技术在真菌分类鉴定研究中可显示对于其分离背景及进化来源的高分辨率及稳定性。2、通过测序分析,筛选出两个具有重要功能的差异基因(RAD23和HST302),且差异位点氨基酸改变对蛋白结构和功能具有一定影响,推测基因RAD23和HST302为引起不同基因型菌株间毒力差异的相关基因。3、通过全基因重测序数据分析证明,应用无义突变SNPs和产生移码突变的InDel进行差异基因筛选的策略具有较好针对性,并筛选出6个潜在与毒力相关的基因。4、通过对所有实验菌株的测序和对全长cDNA的测序验证,最终筛选出基因CNAG_01032为可能引起菌株毒力差异的基因。5、成功构建新生隐球菌CNAG_01032基因的缺陷株和重建株,为后续探明基因功能奠定基础。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：贵阳医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R379.5

【参考文献】