CTLA4Ig修饰树突状细胞诱导对氧化修饰低密度脂蛋白免疫耐受的实验研究

发布时间：2018-01-16 07:36

本文关键词：CTLA4Ig修饰树突状细胞诱导对氧化修饰低密度脂蛋白免疫耐受的实验研究　出处：《山东大学》2008年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 第一部分CTLA4Ig诱导T细胞对氧化修饰低密度脂蛋白免疫无能的研究目的:目前研究认为,动脉粥样硬化是一种炎症性疾病,免疫应答是引起机体炎症反应的重要因素。树突状细胞(dendritic cell,DC)、T淋巴细胞和氧化修饰低密度脂蛋白(oxidized-loW density lipoprotein,ox-LDL)均参与了致动脉粥样硬化的免疫反应。本研究拟采用融合蛋白CTLA4Ig阻断DC上B7与T细胞上CD28结合而传递的共刺激信号,诱导T细胞对ox-LDL的免疫无能,并对机理进行初步探讨,以期发现防治动脉粥样硬化的新策略。方法:分离外周血单个核细胞,黏附法分离单核细胞,加入rhGM-CSF(500IU/ml)和rhIL-4(500 IU/ml)培养6天以诱导DC。在DC中分别加入PBS、LDL(10μg/ml)、ox-LDL(10μg/ml)和LPS(30 ng/ml),作用48小时,流式细胞法检测CD86、HLA-DR等细胞标志。ELISA法检测上清中IL-12的含量。取刺激后的DC与同种异体T淋巴细胞行混合淋巴细胞反应(mixed lymphocytereaction,MLR),ox-LDL组分别加入不同浓度的CTLA4Ig(0、0.31、0.62、1.25μg/ml),MTT法检测T细胞的增殖。分别以流式细胞法和酶联免疫斑点(ELISpot)法检测MLR中T细胞CD25的表达、T细胞的凋亡和细胞因子分泌情况。结果:1、LPS和ox-LDL可以促进DC分泌IL-12,较PBS和LDL有显著性差异。CD86(B7)荧光表达率在LPS和ox-LDL10μg/ml刺激后较对照组(PBS组)均有明显升高(P＜0.05)。HLA-DR(MHC-Ⅱ)的表达中也有相同的表现。CD86和HLA-DR的MFI在oxLDL(10μg/ml)刺激后明显高于对照组(P＜0.05)。2、ox-LDL负载的DC可明显刺激MLR中的T细胞增殖,SI与PBS组和LDL组比较,均有显著性差异(P＜0.05)。3、ox-LDL能促进MLR中T细胞分泌IL-2和IFNV(Th1样细胞因子),较PBS组和LDL组明显升高(P＜0.05)。ox-LDL也能促进MLR中T细胞分泌IL-4(Th2样细胞因子),较PBS组和LDL组明显升高(P＜0.05)。4、CTLA4-Ig可抑制ox-LDL激发的同种异体MLR中T细胞增殖反应,与未应用CTLA4Ig组比较有显著性差异(P＜0.05,P＜0.01)。5、CTLA4-Ig可明显抑制ox-LDL激发的同种异体MLR中T细胞CD25的阳性率,与未应用CTLA4Ig组比较有显著性差异(P＜0.05,P＜0.01)。6、应用CTLA4Ig后,淋巴细胞出现一定程度的凋亡,与未用CTLA4Ig比较有显著性差异(P＜0.01)。7、CTLA4Ig减少IL-2和IFN Y的ELISpot斑点数,较未应用组有显著性差异(P＜0.05,P＜0.01);CTLA4Ig增加IL-4的斑点数,较未应用组有显著性差异(P＜0.05)。结论:1、ox-LDL可以促进DC的表型成熟,激发MLR,证明ox-LDL是一种抗原物质:2、ox-LDL负载的DC激发的MLR中既有Th1型免疫应答,也有Th2型免疫应答;3、CTLA4Ig可以在体外诱导T细胞对ox-LDL的免疫无能;4、CTLA4Ig可以促进ox-LDL负载的DC激发的MLR中的Th1/Th2偏移;5、CTLA4Ig可以抑制ox-LDL负载的DC激发的MLR中的T细胞活化;6、CTLA4Ig可以促进ox-LDL负载的DC激发的MLR中的T细胞凋亡。第二部分CTLA4Ig基因转染对树突状细胞针对氧化修饰低密度脂蛋白免疫功能的影响目的:目前研究认为,动脉粥样硬化是一种炎症性疾病,DC与动脉粥样硬化发生和发展的病理过程密切相关,干预DC功能可能成为防治动脉粥样硬化的重要措施。CTLA4Ig可与抗原递呈细胞的B7-1/2分子结合,阻断抗原递呈细胞和抗原特异性T淋巴细胞之间的共刺激信号传递。CTLA4Ig基因转染DC在移植实验中可以诱导机体对移植物抗原的免疫耐受。本研究拟采用人外周血单个核细胞诱导的DC为研究对象,研究含CTLA4Ig基因腺病毒(Ad-CTLA4Ig)转染DC对动脉粥样硬化相关抗原-ox-LDL免疫反应的影响,以期在体外诱导对ox-LDL的免疫耐受,为进一步的动物实验提供基础。方法:分离外周血单个核细胞,黏附法分离单核细胞,加入rhGM-CSF(500IU/ml)和rhIL-4(500 IU/ml)培养4天,用Ad-CTLA4Ig分别以感染指数(multiplicity of infection,MOI)=100,MOI=200和MOI=300感染DC,以含强化绿色荧光蛋白(Ad-EGFP)转染DC和未转染的DC为对照,继续培养4天。ELISA法检测上清CTLA4Ig的含量。荧光显微镜、流式细胞法和免疫印迹(Western blot)法检测CTLA4Ig的表达情况。取转染3天后的DC,加入ox-LDL(10ug/ml),继续培养48hr。ELISA法检测上清IL-12含量。流式细胞法检测CD86和HLA-DR的表达率。取ox-LDL刺激48hr的基因转染DC、未转染DC及加入10ug/mlCTLA4Ig的未转染DC,与同种异体淋巴细胞行MLR,MTT法检测T细胞的增殖。分别以流式细胞法和酶联免疫斑点(ELISpot)法检测MLR中T细胞CD25的表达、T细胞的凋亡和细胞因子分泌情况。结果:1、CTLA4Ig表达率随着时间逐渐增高,在转染后72小时达到高峰。MOI=200时转染率最高。2、CTLA4Ig基因转染DC经ox-LDL刺激后,IL-12的分泌量明显低于Ad-EGFP转染DC(P＜0.05)和未转染DC(P＜0.05)。3、CTLA4Ig基因转染DC CD86和HLA-DR的表达率明显降低,以CD86的降低明显(P＜0.05)。4、CTLA4Ig基因转染DC在MLR中的SI均明显低于未转染DC和Ad-EGFP转染DC(分别P＜0.05)。5、在ox-LDL负载的CTLA4Ig基因转染DC激发的MLR中,CD25的表达率较未转染DC和Ad-EGFP转染DC明显降低(P＜0.05)。6、在ox-LDL负载的CTLA4Ig基因转染DC激发的MLR中,T细胞凋亡率较未转染DC和Ad-EGFP转染DC明显增高(P＜0.01)。7、在CTLA4Ig基因转染DC激发的MLR中,T细胞分泌的IL-2和IFNγ较空白对照和Ad-EGFP转染DC明显降低(均P＜0.05)。T细胞分泌的IL-4较空白对照和Ad-EGFP转染DC明显升高(P＜0.05)。结论:1、Ad-CTLA4Ig转染人DC的最佳MOI=200,最佳表达时相为转染后72小时。2、Ad-CTLA4Ig转染可以降低DC负载ox-LDL后IL-12的分泌,降低CD86和HLA-DR的表达率和刺激MLR的能力,使DC保持一定的未成熟状态。3、Ad-CTLA4Ig转染DC可以在体外诱导对动脉粥样硬化抗原ox-LDL的免疫耐受。4、Ad-CTLA4Ig转染DC通过降低T细胞的激活、促进T细胞凋亡和促进免疫应答的Th1/Th2偏移等机制来诱导对ox-LDL的免疫耐受。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R392

【参考文献】