TGF-β1、TIMP-1、TIMP-2 RNAi质粒的构建及鉴定

发布时间：2018-01-17 00:36

  本文关键词：TGF-β1、TIMP-1、TIMP-2 RNAi质粒的构建及鉴定　出处：《重庆医科大学》2009年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】： 目的:利用RNA干扰技术,分别以TGF-β1、TIMP-1和TIMP-2为靶基因,构建靶向TGF-β1、TIMP-1和TIMP-2基因的RNA干扰真核表达载体并进行鉴定分析及体外观察干扰效率。 方法:针对目的基因TGF-β1、TIMP-1和TIMP-2分别设计合成编码目的基因的反向重复序列,中间间隔9个核苷酸序列,经退火形成互补双链,通过定向克隆至质粒pGenesil-1,构建siRNA真核表达载体。转化JM109大肠杆菌,提取质粒进行酶切鉴定和测序分析。并体外转染培养的HSC-T6细胞,观察转染效率及对目的基因的抑制效率。 结果:酶切证实目的DNA定向克隆至载体上,测序分析结果与目的序列相同。荧光显微镜下观察,可见大量带荧光的细胞。RT-PCR结果显示,六个特异性的siRNA表达载体均有抑制效果,其中psi-TGF-Β1-1、psi-TIMP1-1、psi-TIMP2-2抑制效率较高。 结论:成功构建了针对TGF-β1、TIMP-1和TIMP-2基因的RNA干扰真核表达载体;将重组质粒成功转染入体外培养的HSC-T6细胞,并且重组质粒显著抑制了目的基因的表达。
[Abstract]:Objective: to construct TGF- 尾 1 targeting TGF- 尾 1 by using RNA interference technique and targeting TGF- 尾 1 TIMP-1 and TIMP-2 as target genes, respectively. The RNA interference eukaryotic expression vector of TIMP-1 and TIMP-2 gene was identified and analyzed and the interference efficiency was observed in vitro. Methods: the reverse repeats of the target gene TGF- 尾 1 TIMP-1 and TIMP-2 encoding the target gene were designed, with an intermediate interval of 9 nucleotide sequences. SiRNA eukaryotic expression vector was constructed by directional cloning into plasmid pGenesil-1 and transformed into JM109 Escherichia coli. The plasmid was identified by restriction endonuclease digestion and sequenced. The transfection efficiency and inhibition efficiency of the target gene were observed by transfection of HSC-T6 cells in vitro. Results: the target DNA was cloned into the vector by restriction endonuclease digestion, and the sequencing result was the same as the target sequence. Under fluorescence microscope, a large number of fluorescent cells. RT-PCR results showed. Among the six specific siRNA expression vectors, psi-TGF- 尾 1-1psi-TIMP1-1psi-TIMP2-2 showed higher inhibition efficiency. Conclusion: the RNA interference eukaryotic expression vector targeting TIMP-1 and TIMP-2 genes of TGF- 尾 1 was successfully constructed. The recombinant plasmid was successfully transfected into HSC-T6 cells in vitro, and the expression of the target gene was significantly inhibited by the recombinant plasmid.
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R346

【共引文献】

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本文编号：1435574