蛋白转导结核DNA疫苗的实验研究

发布时间：2018-01-18 04:36

本文关键词：蛋白转导结核DNA疫苗的实验研究　出处：《武汉大学》2009年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：结核病(tuberculosis, TB)是一种严重危害人类健康的传染病,近年来世界范围内不少地区结核病的发病率和死亡率再度增高。BCG虽然一直被广泛应用于预防结核病,但其保护效果并不稳定,对成人肺结核的保护效应十分有限,而且BCG自身还有着一些难以克服的应用局限性。因此,发展安全、高效的新型结核疫苗已成当务之急。在众多新型抗结核疫苗的研究中,DNA疫苗以其众多的突出优点成为国内外结核疫苗研究的热点之一。自1994年Silva等人率先开展抗结核DNA疫苗的研究以来,迄今已有数十种抗结核DNA疫苗在临床前动物模型试验中表现出良好的效应。遗憾的是,虽然这些疫苗在小动物模型中表现良好,但其在大动物和高等灵长类动物中的表现却常常达不到预期水平。然而,新近四种兽用DNA疫苗的获准面世和DNA疫苗在肿瘤、艾滋病和疟疾等疾病的临床试验中的良好表现再次证明了DNA疫苗在疾病预防和免疫治疗中的应用前景。因此增强结核DNA疫苗的免疫效应成为当前该领域研究的热点。在众多强化DNA疫苗的措施中,蛋白转导(protein transduction)技术的应用是一项较为新颖和较有希望的方式之一。研究表明,来源于几种α-疱疹病毒,如单纯疱疹病毒Ⅰ型(herpes simplex virus, HSV-1)、牛疱疹病毒Ⅰ型(bovine herpes virus, BHV-1)、马立克氏病病毒Ⅰ型(MDV-1)和伪狂犬病毒(pseudorabies virus, PRV)的间质蛋白VP22具有高效的跨膜转运功能和在细胞间自主传递的能力,这种现象被称为“蛋白转导”。进一步的研究发现这些具有蛋白转导能力的VP22分子还能够有效地携带异源蛋白质、多肽和核酸等多种物质进入各种细胞,并介导上述物质从转染的细胞向邻近的细胞间传递,同时保留与之共转运物质的生物学活性和功能。不仅如此,许多研究证实,这些VP22分子还具有明显的免疫佐剂功能,能够显著增强常规DNA疫苗、“自主复制型”RNA疫苗、“自杀性”DNA疫苗、重组病毒载体疫苗的免疫效应以及重组DNA疫苗和重组腺病毒疫苗介导的基因治疗效果。其中,牛疱疹病毒Ⅰ型VP22(BVP22)是迄今发现的具有最强蛋白转导活性的天然分子,在疫苗和基因治疗的研究中具有很高的开发价值和应用潜力。BVP22是否也具有增强结核DNA疫苗的免疫效应的能力?这方面的研究尚未见报道,对该问题的研究不仅可以拓宽蛋白转导技术的应用范围,而且还有望为提高结核DNA疫苗的免疫效应和保护效应提供新思路。抗原85B(Ag85B)是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)感染过程中的重要免疫保护性抗原之一,广泛应用于结核新疫苗的研究中。研究表明,无论是编码Mtb单一Ag85B的质粒或是Ag85B与Mtb其它保护性抗原多基因融合表达的质粒免疫小鼠／豚鼠,都可以诱导有效的免疫应答,并显著减少实验动物脾肺脏器中的荷菌数,延长实验动物的生存时间。不仅如此,研究发现编码MtbAg85B的DNA疫苗还具有较好的免疫治疗效应。鉴于上述研究背景,我们选择了Mtb的Ag85B基因和具有最强蛋白转导效应的牛疱疹病毒Ⅰ型的VP22(BVP22)基因作为本研究的目的基因,构建了BVP22基因与MtbAg85B基因融合表达的DNA疫苗,并观察了该疫苗在C57BL/6小鼠中所诱导的免疫效应和对结核杆菌H37Rv毒株感染的保护效应,对蛋白转导分子BVP22应用于增强结核DNA疫苗效应的可能性作出评价。本实验包括两个部分：第一部分结核杆菌Ag85B与牛疱疹病毒Ⅰ型VP22(BVP22)融合基因疫苗的构建及其免疫学特性研究目的：构建编码结核杆菌Ag85B的DNA疫苗和Ag85B基因与蛋白转导分子BVP22基因融合表达的DNA疫苗,并对两种疫苗的免疫学特性进行比较研究。方法：1、用分子生物学技术构建真核表达质粒pcAg85B, pcBVP22, pcBVP22-Ag85B和表达Ag85B的原核表达质粒pET-Ag85B。经限制性核酸内切酶酶切反应及序列测定证实构建正确后,将纯化的真核表达质粒体外转染HeLa细胞,用RT-PCR和Western blott检测重组质粒在真核细胞中的表达。2、大量制备纯化的真核表达质粒pcAg85B、pcBVP22-Ag85B、pcBVP22和空白载体pcDNA3.1(+),肌肉注射免疫雌性C57BL/6小鼠,连续3次,每次间隔2周。设置相应阴性对照PBS对照组,空载对照组和pcBVP22对照组以及阳性对照BCG组。于末次免疫后六周剖杀小鼠,间接ELISA法检测血清中Ag85B特异性的抗体水平；MTT法检测脾脏中的淋巴细胞特异性增殖能力；ELISPOT检测脾淋巴细胞中分泌IFN-γ和IL-4的T细胞数量,以期对两种质粒的免疫效果作出比较。结果：1、经过限制性核酸内切酶酶切反应及DNA双向测序证实,pcAg85B和pcBVP22-Ag85B融合表达质粒构建成功。真核细胞转染试验证实,两种质粒都能够在HeLa细胞中转录和表达相应的mRNA及蛋白质；2、肌注免疫C57BL/6小鼠后,质粒pcAg85B和pcBVP22-Ag85B均能在小鼠体内有效地诱导体液免疫和细胞免疫应答,均可使小鼠体内的抗原特异性抗体滴度和抗原特异性淋巴细胞增殖能力显著高于PBS对照组、空载对照组和pcBVP22对照组水平(P0.05)；pcAg85B和pcBVP22-Ag85B二组之间的差异也具有显著性(P0.05),后者虽略低于BCG组水平,但经统计学分析差异无显著性(P0.05)；ELISPOT检测结果显示,在pcAg85B和pcBVP22-Ag85B免疫组小鼠的脾脏中分泌IFN-y的淋巴细胞的数量显著多于PBS对照组、空载对照组和pcBVP22对照组(P0.05)；pcBVP22-Ag85B免疫组IFN-y的分泌细胞的数量明显多于pcAg85B免疫组,略低于BCG组,但经统计学分析二组之间无显著性差异(P0.05)。在两种质粒和BCG免疫的小鼠的脾脏中检测到的IL-4生成细胞的数量与PBS对照组、空载对照组和pcBVP22对照组相比,差异无显著性(P0.05)。结论：pcAg85B和pcBVP22-Ag85B两种质粒在C57BL/6小鼠体内均可诱导有效的细胞免疫和体液免疫应答,且融合表达的pcBVP22-Ag85B质粒所诱导的免疫效应均高于单表达结核抗原的pcAg85B。我们推测这种现象可能与BVP22分子的细胞间传递功能有关,BVP22有可能通过携带Ag85B在多种细胞内外“穿梭”,提高了抗原分子在体内进入细胞的能力和抗原呈递的作用,从而增强Ag85BDNA疫苗的免疫原性,其详细机制尚有待进一步的研究。第二部分结核杆菌Ag85B与牛疱疹病毒Ⅰ型VP22(BVP22)融合基因疫苗对结核杆菌感染的保护效应研究目的：建立小鼠结核病模型,探讨重组质粒pcAg85B和pcBVP22-Ag85B对结核分枝杆菌感染机体的保护效应。方法：按第一部分所述方法免疫C57BL/6小鼠。基因免疫结束6周后,每组随机挑选12只小鼠在ABSL-3 (Animal Biosafety Level-3 Laboratory)实验室中经尾静脉感染结核分枝杆菌H37Rv(感染剂量：8×106CFU/只)。攻毒后观察各实验组小鼠一般生存状态、死亡发生时间以及小鼠半数死亡时间(T5o),于感染后35天解剖小鼠(含35天以内死亡冻存的小鼠)。取小鼠的脾及部分肺组织,用来做脏器组织中结核杆菌的荷菌量的观察；另一部分肺组织用来观察各组之间的组织病理学改变,切片做HE染色和抗酸染色检查；同时从每个实验组各取2只存活小鼠以及2只正常未感染小鼠,取脾分离淋巴细胞,经FITC和PE标记后用流式细胞仪检测脾脏中CD4+CD25+T细胞的百分率。通过上述指标的观察,对pcAg85B和pcBVP22-Ag85B的抗感染保护效应作出评价。结果：攻毒后头2周,各实验组小鼠在进食、饮水以及体重方面无明显差异,自攻毒后第三周始,PBS对照组、空载对照组和pcBVP22对照组小鼠开始出现进食减少,精神萎靡,体重减轻等现象,并分别于静脉攻毒后第17天、19天和18天开始出现死亡,而质粒pcAg85B和pcBVP22-Ag85B免疫组小鼠分别于攻毒后第24和30天开始出现死亡。至感染后第35天时,阴性对照PBS组小鼠存活2只,空载对照组存活2只,pcBVP22组存活3只,pcAg85B免疫组小鼠存活5只,pcBVP22-Ag85B免疫组小鼠存活9只,BCG免疫组小鼠全部存活。pcAg85B和pcBVP22-Ag85B两种质粒免疫组小鼠的半数死亡时间均超过PBS对照组、空载对照组和pcBVP22对照组一周以上,pcBVP22-Ag85B组小鼠的半数死亡时间又超过pcAg85B免疫组一周以上。小鼠脾、肺组织中细菌计数结果显示：pcAg85B免疫组小鼠脾、肺组织中细菌计数(1og10CFU)分别为5.3328±0.1031和5.3174±0.0276,pcBVP22-Ag85B免疫组小鼠脾、肺组织中的细菌计数分别为5.0031±0.0774和4.9313±0.0592,显著低于PBS对照组、空载对照组和pcBVP22对照组(分别为6.0065±0.0482、5.9443±0.0345；6.0039士0.0191、5.9362±0.0192；5.9794±0.0559、5.9416±0.0312,P0.05)。其中,pcBVP22-Ag85B免疫组小鼠脾、肺组织中的细菌计数虽略高于BCG免疫组小鼠的相应组织中的细菌计数(4.8669±0.1252、4.7813士0.1129),但差异无显著性(P0.05)。各实验组肺组织HE染色结果显示：PBS对照组、空载对照组和pcBVP22对照组小鼠的肺组织出现广泛性充血、渗出、坏死和实变,肺泡结构消失,有明显肉芽肿结节形成,病变周围有较多炎性细胞浸润。而在质粒pcAg85B和pcBVP22-Ag85B免疫组小鼠的肺组织中病变明显减轻,部分肺泡组织消失,可见炎性渗出及轻度肉芽肿反应,但未见明显坏死。在BCG免疫组小鼠的肺组织中肺泡结构基本完整,伴有少量炎性反应。各实验组抗酸染色结果与HE染色结果相似：在PBS对照组、空载对照组和pcBVP22对照组小鼠的肺组织中结核杆菌数量众多,呈弥漫性簇状或片状分布；在质粒pcAg85B免疫组小鼠的肺组织中结核杆菌呈小片状散在分布,数量较阴性对照组明显减少；在pcBVP22-Ag85B和BCG免疫的小鼠的肺组织中结核杆菌呈零星散在分布,数目稀少。流式细胞术检测结果显示：与正常未感染小鼠相比,结核杆菌感染导致小鼠脾内CD4+CD25+T细胞的百分率明显升高(14.2%vs0.4%)。质粒pcAg85B, pcBVP22-Ag85B以及BCG免疫接种均降低了感染小鼠脾细胞中CD4+CD25+T细胞的百分率,三组分别为1.2%、0.9%、0.6%,与PBS对照组相比差异显著。与质粒pcAg85B组相比,pcBVP22-Ag85B质粒组小鼠脾细胞中的CD4+CD25+T细胞的百分率进一步降低,但仍略高于BCG组。结论：与阴性对照组相比,两种质粒(pcAg85B和pcBVP22-Ag85B)免疫均可显著抑制结核杆菌在小鼠脾、肺组织中的繁殖,明显减轻小鼠肺组织中的病理反应,延长小鼠生存时间,有效保护实验小鼠抵抗结核杆菌H37Rv毒株的攻击感染。与BVP22融合表达的DNA疫苗的保护效应明显超过单表达Ag85B的DNA疫苗,其保护效应接近于BCG。此外,DNA疫苗接种和BCG接种均可减少感染小鼠脾脏中CD4+CD25+T细胞的百分率,融合表达的DNA疫苗比单表达Ag85B的DNA疫苗作用更明显。我们推测融合表达的DNA疫苗在小鼠中表现出较单表达结核杆菌Ag85B的DNA疫苗更好的保护力可能与融合表达的DNA疫苗免疫原性更强有关。此外,融合表达的DNA疫苗的更好表现是否还与它能进一步降低小鼠脾脏中CD4+CD25+T细胞的百分率有关?我们的推测尚有待进一步的研究证实。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R392

【参考文献】