结核融合蛋白疫苗FdxA-Hrp1的构建及对家兔肺部卡介苗潜伏感染模型的治疗作用研究

发布时间：2018-01-19 18:44

本文关键词： 结核分枝杆菌治疗性疫苗亚单位疫苗 Rv2007c Rv2626c 潜伏感染动物模型　出处：《兰州大学》2014年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的：全世界有三分之一的人群感染了结核分枝杆菌,其中有90%的人群处于潜伏感染状态,5%～10%的潜伏感染者未来会发展成为活动性结核,潜伏期的结核分枝杆菌的再活化与复发成为近年来结核病暴发的重要组成,而当前广泛使用的结核疫苗BCG不能杀死处于潜伏期的结核分枝杆菌,无法有效地预防潜伏状态结核分枝杆菌的活化。本研究的主要目的有：(1)筛选结核分枝杆菌在潜伏状态下高表达的抗原。(2)以结核潜伏期抗原为基础构建针对潜伏期结核分枝杆菌的融合蛋白亚单位疫苗。(3)建立易于操作的、安全的、与肺结核的发病机制相似的家兔肺部卡介苗(BCG)潜伏感染模型。(4)利用家兔肺部卡介苗潜伏感染模型评价多个结核亚单位疫苗的治疗作用。该研究对于探讨如何构建潜伏性结核的治疗性疫苗有重要的参考价值。方法：(1)通过文献资料的搜集、整理与分析,找到结核分枝杆菌在不同潜伏模型(不可培养模型、休眠调控子模型、巨噬细胞模型、不可复制模型、生长曲线改变模型、营养缺陷模型和人造肉芽肿模型)中高表达的基因258个,经过筛选得到有较强免疫原性的在多个结核潜伏模型中都有高表达的抗原基因,包括Rv2031c (HspX), Rv2626c (Hrp1), Rv2007c (FdxA), Rv1738和Rv1733c。(2)根据GeneBank数据库中的各个基因的信息,设计特异性引物,以结核分枝杆菌H37Ra菌株的全基因组DNA为模板,PCR扩增出FdxA和Hrpl两个目的基因,将目的基因逐个依次连接在载体质粒pET30a上,构建重组质粒pET30a-FdxA-Hrp1,将该重组质粒转化入大肠杆菌表达菌株BL21中大量表达融合蛋白FdxA-Hrp1(F6)。用镍离子金属鳌合(Ni-NTA)亲和层析的方法纯化带有His标签的融合蛋白F6。(3)用牛分枝杆菌减毒株卡介苗(BCG)和结核分枝杆菌无毒株H37Ra菌株通过气管感染家兔肺部,感染后第十二周肌肉注射地塞米松降低家兔的免疫力,用量是0.5mg/kg,每天一次。连续干预5周后使用深度麻醉的方法使家兔安乐死,解剖家兔,进行肺部结核菌落计数及肺部组织病理切片观察与分析,根据两种分枝杆菌在地塞米松干预后的暴发情况选择合适的建模菌株。我们发现BCG做为感染菌株建立家兔肺部潜伏感染模型,在免疫抑制干预后可以有大量的BCG复活,并有特征性病理改变,故采用BCG建立家兔肺部潜伏感染模型。(4)利用建立的家兔肺部卡介苗潜伏感染模型评价融合蛋白疫苗的治疗作用,使用的融合蛋白疫苗包括：重组了结核潜伏期抗原基因Rv2031c、Rv1738、Rv1733c的融合蛋白HspX-Rv1738-Rv1733c (H83)重组了结核潜伏期抗原基因Rv2007c、Rv2626c的融合蛋白疫苗FdxA-Hrp1(F6),和重组了结核生长期抗原基因ESAT6、Ag85B、Mtb8.4的融合蛋白ESAT6-Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4(EAMM),我们实验室已经证实EAMM对感染结核菌的小鼠具有较强免疫保护力。家兔肺部感染结核菌后应用随机数字表对实验家兔进行完全随机分组：BCG+生理盐水(BCG组),BCG+佐剂(佐剂组)；BCG+(F6+H83)(F6+H83组)；BCG+EAMM (EAMM组)；BCG+EAMM+(F6+H83)(EAMM+F6+H83组),共计五组。疫苗组家兔分别于第5周、第7周、第9周在家兔左前臂用皮下注射的方法进行疫苗治疗干预,生理盐水组和佐剂组家兔在左前臂皮下注射生理盐水和佐剂做对照。五组家兔从第11周开始连续通过肌肉注射地塞米松的方法免疫干预35天。第16周运用深度麻醉的方法使家兔安乐死,进行脏器分离与解剖,主要分离出家兔的胸腺、脾脏和肺脏,对各组家兔的肺部组织进行苏木精伊红染色及抗酸染色观察并进行病理学分析,同时进行结核结节计数及肺脏BCG菌落计数。结果： 1.通过抗原筛选我们得到了5个潜伏期结核高表达的抗原基因Rv2031c、 Rv2626c、Rv2007c、Rvl738和Rv1733c。 2.以潜伏期结核抗原FdxA和Rv2626c为基础构建的融合蛋白F6在大肠杆菌中可溶性稳定表达,并且可以运用镍离子层析柱得到较高纯度的蛋白。 3.成功建立了家兔肺部卡介苗潜伏感染模型,通过气管感染途径使家兔肺脏感染卡介苗BCG,4周后从家兔肺部组织中培养不出分枝杆菌,但经过地塞米松的免疫抑制剂干预后引起分枝杆菌的大量暴发,可以从肺脏中培养出大量的分枝杆菌。 4.利用建立的家兔肺部卡介苗潜伏感染模型,对融合蛋白疫苗的治疗效果进行评价,发现疫苗组家兔肺部载菌量(EAMM组7.9×103；F6+H83组3.2×103；EAMM+F6+H83组1.6×103)均明显低于对照组(BCG组1.2×105；佐剂组5.7×104),p值均小于0.05, p(EAMM vs BCG)=0.0015,p(F6+H83vs BCG=0.0015, p(EAMM+F6+H83vs BCG)=0.0001, p(EAMM vs佐剂)=0.0368,p(F6+H83vs佐剂)=0.00326,p(EAMM+F6+H83vs佐剂)=0.0001；EAMM+F6+H83组家兔肺部载菌量明显低于EAMM组或F6+H83组,p(EAMM+F6+H83vs EAMM)=0.00003, p(EAMM+F6+H83vs F6+H83)=0.0216,而F6+H83联合疫苗组家兔肺部载菌量明显低于EAMM组,p(F6+H83vs EAMM)=0.0209。结论： 1.家兔肺部卡介苗潜伏感染模型可以用于融合蛋白疫苗的结核治疗作用初步评价；家兔肺部BCG潜伏感染模型提供了一个简单易行并且安全有效的结核治疗效果评价模型,为今后结核疫苗、抗结核药物及相关的免疫调节剂的结核治疗作用研究打下基础。 2.新构建的结核融合蛋白疫苗(F6+H83)对于潜伏状态的BCG有一定的清除能力。 3.以结核菌潜伏状态下高表达的抗原为基础构建的疫苗(F6+H83)和以结核菌生长状态下高表达的抗原为基础构建的疫苗(EAMM)联合使用可以明显降低家兔肺部潜伏存在的BCG。
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【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392

【共引文献】