弓形虫表面抗原SAG4基因的克

发布时间：2018-01-20 19:11

  本文关键词： 弓形虫 SAG4 克隆表达 免疫反应性　出处：《广西医科大学》2008年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 目的:获取弓形虫表面抗原SAG4目的基因序列,预测其编码蛋白作为候选疫苗的可行性。构建重组表达质粒pET28a(+)-SAG4,在大肠埃希菌表达系统中表达SAG4,并检测表达产物的免疫反应性,为弓形虫病的免疫诊断和疫苗研制奠定基础。 方法:提取RH株弓形虫的基因组DNA,根据GenBank中RH标准株弓形虫的SAG4基因序列设计引物,PCR法体外扩增获取目的基因片段。PCR产物经测序鉴定及胶回收纯化后,连接入pMD19-T载体中以构建重组克隆质粒pMD19-T-SAG4。用限制性内切酶NcoⅠ、XhoⅠ从pMD19-T-SAG4中切下目的基因,亚克隆入pET28a(+)载体中构建重组表达质粒pET28a(+)-SAG4,并采用双酶切反应及测序方法鉴定重组体。用生物信息学方法对重组SAG4基因编码序列进行同源性分析以及二级结构和抗原表位的预测。将重组表达质粒pET28a(+)-SAG4转入大肠埃希菌BL21中,经IPTG诱导表达后,用SDS-PAGE及蛋白质印迹(Western blotting)技术分析鉴定表达产物的免疫反应性。 结果:PCR体外扩增获得的目的基因片段长537bp,经BLAST同源性分析显示该序列与RH株弓形虫SAG4基因cDNA具有高度同源性,而与其他生物的同源性较低。双酶切反应及测序分析显示,SAG4目的基因已被正确地连接入重组克隆质粒pMD19-T-SAG4和重组表达质粒pET28a(+)-SAG4中。BLAST比对及疏水性分析表明,重组基因编码产物为RH株弓形虫SAG4,是一种外膜蛋白;二级结构预测该产物可形成多个无规卷曲和β-转角区域;亲水性、可及性、柔韧性、极性参数及抗原表位的综合预测显示,其氨基酸序列的第40,80,120,130位点附近的抗原性指数较高。重组表达质粒pET28a(+)-SAG4经IPTG诱导后,在BL21中以包涵体的形式稳定表达SAG4。SDS-PAGE检测可发现一特异性蛋白区带,分子量约为18.74 ku,Western blotting分析显示该条带能被弓形虫慢性感染血清识别。 结论:首次从RH株弓形虫中克隆出缓殖子期特异性抗原SAG4基因编码序列;成功构建了SAG4目的基因的重组克隆质粒pMD19-T-SAG4与重组表达质粒pET28a(+)-SAG4;生物信息学分析技术预测出重组SAG4基因编码产物具有良好的抗原性;重组表达质粒pET28a(+)-SAG4在大肠埃希菌BL21中以包涵体形式高效表达了SAG4目的基因片段,该产物具有特异的免疫反应性。以此推测出SAG4不但是具有良好应用前景的弓形虫候选疫苗分子,还有望应用于弓形虫慢性感染的检测。
[Abstract]:Objective: to obtain the target gene sequence of Toxoplasma gondii surface antigen (SAG4) and predict the feasibility of its coding protein as a candidate vaccine, and construct the recombinant expression plasmid pET28a (pET-SAG4). SAG4 was expressed in Escherichia coli expression system, and the immunoreactivity of the expressed product was detected, which laid a foundation for immunological diagnosis and vaccine development of toxoplasmosis. Methods: the genomic DNA of Toxoplasma gondii was extracted from RH strain and primers were designed according to the SAG4 gene sequence of RH standard strain Toxoplasma gondii in GenBank. The target gene fragment was amplified by PCR in vitro. The product was sequenced and purified by gel recovery. The recombinant plasmid pMD19-T-SAG4 was constructed by ligation into pMD19-T vector. Nco 鈪，

本文编号：1449240