CpG-ODN和多肽刺激外周血单个核细胞杀伤HepG2研究

发布时间：2018-01-31 17:17

  本文关键词： CpG-ODN 多肽 细胞免疫 聚合酶链反应 MTT　出处：《广东药学院》2009年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 目的 通过将CpG-ODN和多肽单独或联合刺激外周血单个核细胞(PBMC),将活化后的PBMC与HepG2细胞共培养,对HepG2细胞进行杀伤,评价并比较CpG-ODN和多肽的刺激PBMC的杀伤HepG2效应,研究CpG-ODN的免疫激活功能和初步机制;进一步研究CpG-ODN和多肽单独或联合刺激激活PBMC的作用机制,进而探讨CpG-ODN免疫激活功能的作用机制和CpG-OND刺激PBMC杀伤肿瘤的凋亡机制,初步探讨多肽刺激激活PBMC杀伤HepG2的效果和机制。 方法 将还有CpG寡核苷酸序列的pUC18载体,转化大肠杆菌DH5α,涂布于氨苄平板37℃培养,挑取阳性若干菌落于37℃小量液体培养,试剂盒抽提质粒,酶切电泳鉴定;将成功转化的大肠杆菌扩大培养,去内毒素质粒大量抽提试剂盒抽提质粒,紫外分光光度法鉴定质粒纯度并计算含量。针对肝肿瘤细胞的特点,设计针对甲胎蛋白的特异性抗原多肽,由公司合成特异性抗原多肽,多肽纯度达到适合细胞试验水平。使用植物凝集素作为刺激PBMC增殖的阳性对照,使用多肽、CpG-ODN、乙肝表面抗原、pUC18质粒作为刺激物作用于PBMC,MTT法检测PBMC增殖效果,使用Excel统计作图。设计合成针对TLR9通道的MyD88、TLR9、Hsp70的PCR引物,以β-actin作为对照,不同浓度CpG-ODN刺激PBMC,提取总RNA并进行反转录后进行多聚酶链反应,琼脂糖凝胶电泳检测MyD88、TLR9、Hsp70的表达情况。使用多肽、CpG-ODN和多肽联合CpG-ODN刺激PBMC后对HepG2进行杀伤,MTT法检测杀伤效果,使用Excel统计作图。提取PBMC杀伤后的HepG2总RNA,反转录并使用Bcl-XL/S、ich3、Bid、Bcl-2为引物做聚合酶链反应,以β-actin作为对照,琼脂糖凝胶电泳检测杀伤后HepG2的凋亡情况。 结果 CpG-ODN能有效刺激人外周血单个核细胞增殖,刺激PBMC增殖较为稳定,作为佐剂,与多肽联用具有更好的刺激增殖作用,但作为核酸与蛋白质相比,蛋白抗原的刺激增殖能力更强;用不同剂量CpG-ODN刺激PBMC,在1μg/mL浓度时,TLR9通道的mRNA转录活性较强,0.1μg/mL和10μg/mL浓度mRNA转录活性低于1μg/mL浓度,抗凋亡因子Bcl-2的mRNA同样在1μg/mL浓度有转录,但三个浓度Hsp70都无表达。在48h时间点,经CpG-ODN介导活化的PBMC对HepG2肿瘤细胞的有很强的杀伤活性,其中CpG单用组的杀伤能力最高。在48h的杀伤能力明显高于在72h的杀伤能力。CpG单用组、CpG联合多肽组、多肽单用组、PBMC无刺激物对照组和HepG2组在72h检测时间点上增殖活性均显著高于48h检测时间点上的增殖活性。PCR结果中,多肽和CpG-ODN联用凋亡因子Bcl-XL和Bid都有表达,单用多肽Bid也有表达。 结论:CpG-ODN和多肽能有效刺激发生PBMC增殖反应,CpG-ODN刺激PBMC细胞亚群较为广泛,多肽刺激PBMC的细胞亚群具有一定的特异性。CpG-ODN刺激PBMC增殖效果稳定,与蛋白质或者多肽联用刺激PBMC有一定的协同刺激作用。在合适浓度情况下,CpG-ODN刺激PBMC具有抗凋亡作用。CpG-ODN和多肽刺激PBMC后,PBMC杀伤HepG2能力增强,设计合成的多肽能与淋巴细胞肿瘤表位结合,特异性激活T细胞,CpG-ODN联合多肽刺激PBMC杀伤HepG2能力具有一定的协同效应。
[Abstract]:Purpose The effects of CpG - ODN and polypeptide on the anti - tumor activity of PBMC induced by CpG - ODN and polypeptide were evaluated and compared . The mechanism of CpG - ODN and the action of CpG - ODN and CpG - ODN were further studied . method The recombinant plasmid of MyD88 , TLR9 and Hsp70 was designed and synthesized . Results CpG - ODN could stimulate the proliferation of human peripheral blood mononuclear cells and stimulate PBMC to proliferate more stably . As an adjuvant , the expression of anti - apoptotic factor Bcl - 2 was higher than that at 48h . Conclusion : CpG - ODN and polypeptide can stimulate PBMC to proliferate . CpG - ODN can stimulate PBMC to have a certain specificity . CpG - ODN can stimulate PBMC proliferation . CpG - ODN can stimulate PBMC to have anti - apoptotic effect . CpG - ODN and polypeptide can stimulate PBMC to have anti - apoptotic effect .

【学位授予单位】：广东药学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R392

【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 孟民杰;郭晓磊;戴帆;;多种属CpG ODN诱导特异性抗体反应的研究[J];广东药学院学报;2007年03期

2 孟民杰;郭晓磊;叶f，

本文编号：1479583