Bcl-x选择性剪接微基因报告方法的建立

发布时间：2018-02-04 23:12

本文关键词： 选择性剪接 bcl-xL/bcl-xS 细胞凋亡顺式作用元件反式作用因子微基因报告法　出处：《南昌大学》2010年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 研究目的：选择性剪接是指细胞选择性地对pre-mRNA(前mRNA)剪接位点的组合剪接加工,形成不同的成熟mRNA,从而使一个基因产生若干有独特结构和功能的蛋白异构体的过程,它是真核生物控制基因表达的一种重要机制。通过选择性剪接,能够大大增加人类基因组的蛋白编码能力,从而满足多种生理功能的需要。人类基因组中包含大量前mRNA正确剪接所需的顺式元件,剪接的异常可导致相关疾病的发生。微基因是指将待研究的相关基因组片段插入真核表达载体启动子下游及终止序列之间而构建的重组载体,该重组质粒能在真核细胞内转录出前mRNA,并在细胞不同的生理、病理状态下剪接出不同mRNA产物。微基因用于监测mRNA在不同情况下选择性剪接可能发生的变化,是研究选择性剪接发生机制的经典方法。人类凋亡相关基因bcl-x选择性剪接异常与多种肿瘤的发生发展密切相关,本文通过构建bcl-x微基因及其相关顺式作用元件的突变微基因,建立bcl-x基因选择性剪接微基因报告法,为阐明bcl-x基因在疾病情况下发生异常选择性剪接的机制打下基础。研究方法： 1.聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)扩增bcl-x基因组目的片段：用PCR方法从K562细胞基因组DNA中扩增出bcl-x基因外显子2及内含子2的5′端部分序列片段(P1P2)；另外还扩增出bcl-x基因内含子2的3′端及外显子3部分序列(P3P4)； 2.定向克隆的方法构建微基因pcDNA3.1(-)-bcl-x:首先将真核表达质粒pcDNA3.1 (-)和P1P2片段分别进行Xbal和Xhol双酶切反应,然后将双酶切后的两片段进行DNA琼脂糖凝胶电泳并回收,用T4连接酶将两片段连接起来,得到质粒pcDNA3.1(-)-P1P2,经转化感受态细菌、筛选阳性菌落、提取质粒及双酶切,测序鉴定所构建的质粒的正确性,经鉴定无误后再将质粒pcDNA3.1(-)-P1P2和P3P4片段分别进行Xhol和EcoRI双酶切反应,并将酶切后的片段进行回收,同样使用T4连接酶将两片段连接起来,得到质粒pcDNA3.1(-)-P1P2-P3P4,即pcDNA3.1(-)-bcl-x,经转化感受态细菌、筛选阳性菌落、提取质粒及双酶切,测序鉴定所构建的质粒,即bcl-x微基因； 3.反向PCR法构建bcl-x基因重要顺式元件CRCE1、CRCE2、B2G的突变微基因：以鉴定无误后的pcDNA3.1(-)-bcl-x微基因为模板,通过设计致使顺式元件CRCE1、CRCE2、B2G发生突变的引物,进行反向PCR；然后用酶Dpnl对模板质粒DNA进行消化,并使PCR产物产生自身环化反应,最后将环化后的PCR产物转化感受态细菌,筛选阳性菌落、提取质粒进行酶切、测序鉴定。 4.RT-PCR监测bcl-x微基因及其突变微基因在HL60细胞内的转录：将构建好的bcl-x微基因及其突变微基因用脂质体(lipofectamine2000)转染的方法转染HL60细胞,转染48小时后用TRNzol提取细胞总RNA,并行逆转录反应得到cDNA,以cDNA为模板设计特异引物进行PCR反应,检测细胞中bcl-xL/bcl-xS mRNA水平的变化。研究结果： 1：经琼脂糖凝胶电泳显示：PCR反应扩增出正确大小的bcl-x基因组片段(P1P2,P3P4); 2：经酶切,测序实验鉴定后,构建的微基因pcDNA3.1(-)-bcl-x中没有发现错误的碱基突变；微基因pcDNA3.1(-)-bcl-x瞬时转染HL60细胞后,能够在细胞内进行转录； 3:bcl-x微基因的突变体pcDNA3.1(-)-bcl-x-CRCE1(M)、pcDNA3.1(-)-bcl-x-CRCE2(M)、pcDNA3.1(-)-bcl-x-B2G(M)经酶切,测序鉴定没有发现错误突变；每个突变微基因瞬时转染HL60细胞后,均能够在细胞内进行转录； 4:RT-PCR实验表明：bcl-x微基因转染HL60细胞后bcl-xL/bcl-xS为1.4, bcl-x基因顺式作用元件B2G、CRCE1、CRCE2对bcl-xL/bcl-xS有一定影响,pcDNA3.1(-)-bcl-x-B2G(M)、pcDNA3.1(-)-bcl-x-CRCE1(M)转染HL60细胞后,RT-PCR电泳结果显示bcl-xS几乎消失；pcDNA3.1(-)-bcl-x-CRCE2(M)转染HL60细胞后,RT-PCR电泳结果显示bcl-xL/bcl-xS为1.6。结论： 1.成功地扩增出包含bcl-xS, bcl-xL剪接位点及其可能的调控元件的bcl-x基因组片段：P1P2,P3P4； 2.定向克隆的方法成功地构建出人类凋亡相关基因bcl-x的微基因；反向PCR方法成功地构建出bcl-x相关顺式作用元件的突变微基因：pcDNA3.1 (-)-bcl-x-B2G(M)、pcDNA3.1(-)-bcl-x-CRCE 1(M)、pcDNA3.1 (-)-bcl-x-CRCE2(M); 3.bcl-x微基因及其突变微基因均能在HL60细胞内进行转录,并且bcl-xL/bcl-xS mRNA的比值受顺式元件B2G、CRCE1、CRCE2的影响：顺式作用元件B2G缺失和CRCE1突变使bcl-xS几乎消失,CRCE2突变也使bcl-xL/bcl-xS比值上升。
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【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R341

【参考文献】