人ZHX2多克隆抗体的制备与应用

发布时间：2018-02-05 01:41

本文关键词： ZHX2 多克隆抗体肝癌融合蛋白抑癌基因　出处：《山东大学》2009年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： ZHX2(zinc finger homodomain box 2)是2003年发现的新型转录抑制因子,其目前已知的三个靶基因均在肝癌中特异性高表达。我们的前期研究结果显示ZHX2参与人肝癌细胞AFP表达调控,并抑制肝癌细胞生长。另有研究显示ZHX2参与多种疾病发生,其表达与多发性骨髓瘤病人预后负相关。因而,ZHX2可能在肿瘤诊断和治疗中具有重要研究价值。研究目的在原核细胞中表达人ZHX2的融合蛋白GST-ZHX2作为抗原,制备多克隆抗体,并利用该抗体检测肝癌组织及不同肿瘤细胞系中ZHX2的表达。研究方法 1 GST-ZHX2融合蛋白的表达 ZHX2融合蛋白表达载体pGEX-ZHX2(1-837AA)、pGEX-ZHX2(263-497AA)与空载体pGEX-5X-1分别经CaCl_2法转化E.coli BL21(DE3)菌株,抽提质粒并经酶切、测序鉴定。以终浓度为1mM的IPTG诱导工程菌表达目的蛋白,6h后收集菌体和上清液,分别进行SDS-PAGE电泳,考马斯亮蓝染色后,凝胶成像分析电泳图像,通过Quantity One分析融合蛋白表达率。 2多克隆抗体制备 GST-ZHX2(1-837AA)、GST-ZHX2(263AA-497AA)融合蛋白分子量约118KDa和52KDa,GST蛋白分子量26KDa。将上述菌体蛋白经SDS-PAGE电泳,考马斯亮蓝染色后,对照分子量Marker,切取目的蛋白条带的胶条(约含200gg融合蛋白)作为抗原,并添加2mlPBS后充分研磨,获得“胶体-蛋白”乳浊液。将其与弗氏完全佐剂按照体积比2:1比例混合,多点注射入新西兰大耳兔背部皮下,每2周免疫一次,共计3次(后两次加强免疫时将含有200μg融合蛋白的胶条按照2:1比例与弗氏不完全佐剂混匀)。最后一次免疫后14天,心脏采血法采血,利用饱和硫酸铵法对兔血清中的免疫球蛋白进行粗提,分装后-80℃保存,两种ZHX2-GST融合蛋白免疫后血清分别标记为ZHX2(1-837AA)pAb和ZHX2(263-497AA)pAb。 3抗体特异性检测利用本实验室构建的ZHX2真核表达载体pcDNA3-ZHX2-HA及空载体pcDNA3分别转染HepG2。48h后收集细胞,并分别利用上述制备的两种多克隆抗体和商品化HA抗体(1:2000稀释),进行western blot实验,检测转染后HepG2细胞内相应蛋白的表达。多克隆抗体按照1:100,1:500,1:1000,1:2000,1:4000比例稀释,用于验证该抗体对抗原识别的特异性,并确定抗体最适滴度。 4抗体应用收集肝癌切除术术后组织标本和不同肿瘤细胞系细胞,SDS裂解液提取组织蛋白及细胞蛋白,利用自行制备的ZHX2多克隆抗体进行Western blot,检测ZHX2在肝癌组织及不同肿瘤细胞系中的表达水平。结果 1 ZHX2融合蛋白在原核细胞中的表达 1.1重组质粒pGEX-ZHX2(1-837AA)、pGEX-ZHX2(263-497AA)的鉴定重组质粒CaCl_2法转化大肠杆菌BL21(DE3),抽提阳性重组子质粒DNA,经BamHI和NotI双酶切,酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳,可见分子量约为2500bp与700bp左右的特异性条带,与预期结果一致。DNA测序分析及BLAST对比分析证明,重组载体插入序列正确,pGEX-ZHX2(1-837AA)、pGEX-ZHX2(263-497AA)内分别含有编码ZHX2 1-837位氨基酸及263-497位氨基酸的相应编码序列。 1.2 GST-ZHX2(1-837AA)、GST-ZHX2(263-497AA)融合蛋白在原核细胞中的表达工程菌经IPTG诱导6h后,分别收集菌体及上清,进行SDS-PAGE电泳,考马斯亮蓝染色显示:IPTG诱导的阳性工程菌菌体蛋白电泳后在118KDa、52KDa左右位置发现明显深染蛋白条带,而未经IPTG诱导的对照组未见该条带。上述结果提示:融合蛋白GST-ZHX2(1-837AA)、GST-ZHX2(263-497AA)可以在E.coli BL21(DE3)菌体中表达。收集等量菌体总蛋白,SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色后,扫描胶体,利用Quantity One分析各条带灰度,计算蛋白表达量。结果显示:融合蛋白表达率分别为GST-ZHX2(1-837AA)5.4%,GST-ZHX2(263-497AA)10.9%和GST11.7%。 2 ZHX2多克隆抗体的制备 2.1抗原制备大量培养工程菌,收集菌体蛋白,进行SDS-PAGE电泳,切取目的蛋白染色胶条[GST-ZHX2(1-837AA),118KDa;ZHX2-GST(263-497AA),52KDa;GST,26KDa)],根据蛋白表达率,按照每只兔子每次需要0.2mg抗原计算免疫动物所需胶体量,并秤取相应胶条。 2.2 ZHX2多克隆抗体的制备及验证 3次增强免疫结束后,采集并分离血清,硫酸铵沉淀法粗提血清免疫球蛋白IgG,用于Western blot检测pcDNA3-ZHX2-HA转染后HepG2细胞中的ZHX2蛋白。ECL显色结果显示,商品化HA抗体可检测出pcDNA3-ZHX2-HA转染组中ZHX2-HA融合蛋白的表达,蛋白条带位置在92KDa处;ZHX2(263-497AA)pAb、ZHX2(1-837AA)pAb亦可在相同位置检测出的目的条带,但ZHX2(1-837AA)pAb显色后出现较多的非特异性杂带。未转染组和pcDNA3转染组内,各抗体均未检测到ZHX2表达。上述结果提示,ZHX2(263-497AA)pAb可以与ZHX2抗原进行特异性结合,用于后续实验。利用不同稀释度的ZHX2多克隆抗体和相应的HRP羊抗兔酶标二抗,重复上述实验。结果证实一抗最佳抗体稀释度为1:1000,二抗稀释度1:500时实验结果最佳。 3抗体的应用 (1) ZHX2多克隆抗体检测不同肿瘤细胞系中ZHX2表达培养不同肿瘤细胞,并于对数生长期收集细胞,裂解后进行western blot。结果显示,ZHX2(263-497AA)pAb多克隆抗体作用后,肝癌细胞系Bel-7402,SMMC-7721细胞中92Kda处可见特异性条带,而HepG2和HepG2.2.15细胞中未见该条带,与本室原有结果相符。提示,自行制备的ZHX2多克隆抗体具有良好的特异性和灵敏度,可以用于检测培养细胞系中的ZHX2的表达。而在肺腺癌细胞系A549,子宫颈癌细胞系Hela,胃癌细胞系MGC-803和SGC-7901以及腺鳞癌细胞系的SKOV-3细胞内均查出ZHX2的表达,但表达强弱不同。 (2) ZHX2多克隆抗体检测不同肝癌组织标本中的ZHX2表达随机选取10名肝癌患者手术后肝癌组织标本,抽提组织蛋白后,用自行制备的ZHX2(263-497AA)pAb进行western blot检测。结果显示不同患者肝癌组织中均有ZHX2表达,但表达水平不一致。提示自行制备的多克隆抗体可以用于组织内蛋白检测,为进一步研究ZHX2与肝癌关系提供了有利生物材料。结论成功制备并鉴定ZHX2多克隆抗体,并用该抗体进行western blot检测肿瘤细胞系和肝癌标本内源性ZHX2的表达。结果显示,制备的ZHX2多克隆抗体可以用于体内外检测,为进一步研究ZHX2与肿瘤关系及ZHX2功能研究提供了必要的条件。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R392

【引证文献】