弓形虫排泄—分泌抗原（ESA）对小鼠部分免疫细胞亚群的影响

发布时间：2018-02-09 17:45

本文关键词： 刚地弓形虫排泄-分泌抗原 CD~(4+)CD~(25+)调节性T细胞 CD~(4+)T细胞 NK细胞凋亡　出处：《南京医科大学》2009年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是人畜共患细胞内寄生原虫。免疫功能正常机体感染弓形虫,绝大多数为隐性感染,但孕妇、婴幼儿和免疫抑制者感染后,则可能导致流产、畸胎或急性获得性弓形虫病,死亡率甚高,危害严重。本实验室前期研究发现,弓形虫RH株感染能够引起孕鼠体内CD~(4+)CD~(25+)调节性T细胞(Treg)数量下降,凋亡率增加。同时,越来越多的证据表明,CD~(4+)CD~(25+)调节性T细胞在怀孕免疫耐受状态维持中起到尤为重要的作用,提示感染引起的CD~(4+)CD~(25+)调节性T细胞的减少在弓形虫感染致流产发生过程中可能起到重要作用。弓形虫是一种细胞内寄生原虫,虫体侵入宿主细胞后,在细胞内大量繁殖,排泄分泌大量抗原性物质,即弓形虫ESA(excreted-secreted antigens),参与引起宿主损伤和免疫反应。然而目前为止有关这些虫源性物质对机体免疫细胞的影响,研究还不深入。目前在小鼠模型上的研究发现,ESA同样可以导致孕鼠流产,引起体内CD~(4+)CD~(25+)调节性T细胞数量下降。这些研究表明,ESA对机体所产生的影响与弓形虫感染所致的影响相似。那么弓形虫ESA所致的孕鼠流产是否也和体内CD~(4+)CD~(25+)调节性T细胞的减少有关?ESA对正常机体的免疫细胞有何影响?结合上述资料和问题,本研究旨在探讨ESA致孕鼠流产过程中CD~(4+)CD~(25+)调节性T细胞所发挥的作用,观察ESA对正常小鼠体内CD~(4+)T细胞、CD8+T细胞、NK细胞的影响,并初步探讨其变化机制,为今后弓形虫病的免疫预防和干预提供理论基础。我们首先建立刚地弓形虫感染孕鼠模型和ESA处理孕鼠模型,通过尾静脉过继CD~(4+)CD~(25+)调节性T细胞,观察各组孕鼠流产率的变化。之后,建立ESA处理正常小鼠模型,流式细胞术检测小鼠脾脏中CD~(4+)T细胞、CD8+T细胞、NK细胞数量比例变化。采用3H-TdR掺入细胞增殖实验检测不同处理组脾脏CD~(4+)CD~(25+)调节性T细胞抑制功能;同时采用ELISA检测正常CD~(4+)CD25-T细胞与不同处理组脾脏CD~(4+)CD~(25+)调节性T细胞共培养后其细胞因子(IFN-γ、IL-4)的分泌水平;采用LDH法检测NK细胞的杀伤功能变化;然后应用AnnexinV和7-AAD联合标记染色法检测小鼠脾脏中CD~(4+)T细胞、CD8+T细胞、NK细胞凋亡率变化;采用RT-PCR方法检测Fas和caspase3 mRNA在脾脏CD~(4+)T细胞中表达水平。最后采用AnnexinV和7-AAD联合标记染色法检测ESA体外在不同培养体系下对CD~(4+)T细胞的凋亡率的变化。本研究获得如下主要结果: 1.体内过继正常孕鼠脾脏CD~(4+)CD~(25+)调节性T细胞能使ESA所致孕鼠的流产率下降我们发现,与正常孕鼠相比,ESA处理孕鼠流产发生率显著增加,ESA处理后6天(孕14天),所有胚胎和胎盘均发生出血、坏死及吸收,流产率为100%,而过继孕鼠CD~(4+)CD~(25+)调节性T细胞后,部分胚胎存活,流产率下降为60%。然而,过继孕鼠CD~(4+)CD~(25+)调节性T细胞却不能有效降低弓形虫感染所致的流产。 2. ESA处理小鼠脾脏CD~(4+)T细胞数量减少,NK细胞数量增加流式细胞仪检测结果显示,不同剂量ESA处理小鼠,脾脏CD~(4+)CD~(25+)Foxp3+T细胞占脾细胞的比例均下降,尤其以注射100μl ESA下降最明显,因此,接下来我们采用100μl ESA注射小鼠建立小鼠模型,观察各细胞亚群变化。流式结果发现,与对照组相比,CD~(4+)T细胞比例在第2天开始下降,但差别没有统计学意义;在注射后第4天,调节性T细胞比例明显降低;到了注射后第6天,比例进一步降低,显著低于同期对照组水平。与CD~(4+)T细胞的变化相一致,CD~(4+)CD~(25+)Foxp3+T细胞占脾细胞的比例也随着ESA处理时间呈下降趋势。ESA各处理组小鼠脾脏CD8+T细胞占脾细胞的比例虽有下降趋势,但与对照组相比差异没有统计学意义。然而,ESA处理小鼠脾脏NK占脾细胞的比例在ESA处理后第4天和第6天则明显升高。 3. ESA处理小鼠脾脏CD~(4+)CD~(25+)调节性T细胞的抑制功能减弱3H-TDR掺入法细胞增殖实验结果发现,在抗CD3的刺激下,ESA处理2天组小鼠脾脏CD~(4+)CD~(25+)T细胞抑制CD~(4+)CD25-T细胞增殖的能力较正常对照组明显下降,第4天下降更明显,第6天组则与第4天组持平。ELISA结果显示,ESA注射组CD~(4+)CD~(25+)调节性T细胞与正常CD~(4+)CD25-T细胞共培养后IFN-γ分泌水平较对照组升高,并随着ESA注射时间延长,共培养后IFN-γ分泌水平不断升高,显著高于对照组水平。由此显示,在实验观察期内,CD~(4+)CD~(25+)调节性T细胞随着ESA注射天数的延长,抑制能力不断下降。 4. ESA处理小鼠脾脏NK细胞杀伤功能增强,NK细胞体外与ESA共培养后,其杀伤功能也增强LDH法检测结果显示,ESA处理组小鼠脾脏NK细胞杀伤靶细胞YAC-1的功能在处理第2天开始增强,第4天继续增强,到第6天有所下降,但仍高于对照组;体外NK细胞与ESA共培养,其杀伤靶细胞YAC-1的功能也增强。 5. ESA处理小鼠脾脏CD~(4+)T细胞发生凋亡,CD~(4+)T细胞中FAS和caspase3 mRNA表达量增加流式细胞仪检测结果显示,ESA注射小鼠第2天组脾脏CD~(4+)CD~(25+)T细胞的凋亡率与对照组相比没有明显升高,到第4天凋亡率开始明显升高,而第6天继续上升;CD~(4+)CD25-T细胞的凋亡率也随着ESA注射时间延长呈不断上升趋势。ESA处理小鼠脾脏NK细胞的凋亡率与对照组比较差异无统计学意义。RT-PCR结果显示,脾脏CD~(4+)T细胞中Fas mRNA表达水平,在ESA处理后第2天和第4天都有上升的趋势,但差别没有统计学意义,到处理后第6天,其表达水平与对照组比明显升高;脾脏CD~(4+)T细胞中caspase3 mRNA表达水平在ESA处理后第2天开始高于对照组,但差异没有统计学意义,到第4天继续升高,至处理后第6天,显著高于对照组水平。 6. ESA体外与混合脾淋巴细胞共培养,其CD~(4+)T细胞凋亡率增加; ESA体外单独与CD~(4+)T细胞共培养,不能引起CD~(4+)T细胞凋亡流式细胞仪检测结果发现,当弓形虫ESA与脾淋巴细胞共培养时,其中CD~(4+)T细胞的凋亡率与正常对照组相比增加,而当弓形虫ESA单独与CD~(4+)T细胞共培养时,凋亡率与对照组比较无统计学差异。本实验采用尾静脉过继CD~(4+)CD~(25+)调节性T细胞与ESA处理鼠体内,发现ESA处理孕鼠在过继Treg后其流产率显著降低,以此为研究线索,建立ESA处理小鼠模型研究ESA体内对CD~(4+)T细胞、CD8+T细胞、NK细胞的影响,发现ESA处理小鼠脾脏CD~(4+)T细胞数量减少,CD~(4+)T细胞亚群中的CD~(4+)CD~(25+)调节性T细胞功能减弱,而CD~(4+)T细胞的减少可能与Fas、caspase3介导的相关凋亡通路激活有关。与之相反,ESA处理小鼠脾脏NK细胞数量增加,功能增强。进一步体外实验发现,ESA只有与混合脾脏淋巴细胞共培养时才能引起CD~(4+)T细胞的凋亡,其单独与CD~(4+)T细胞培养并不能引起CD~(4+)T细胞的凋亡。以上研究结果提示,CD~(4+)CD~(25+)调节性T细胞的减少在ESA致孕鼠流产过程中起到重要作用;ESA并不是直接的对CD~(4+)T细胞(包括CD~(4+)CD~(25+)调节性T细胞)产生毒性作用,而是可能通过其他途径间接诱导CD~(4+)T细胞的凋亡;ESA具有增强NK细胞功能的作用。
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【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R392

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