单纯疱疹病毒Ⅱ型LAT基因ORF2对Vero细胞的抗凋亡作用研究

发布时间：2018-03-08 06:28

  本文选题：单纯疱疹病毒2型　切入点：开放读码框2　出处：《华南理工大学》2010年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 单纯疱疹病毒Ⅱ型(Herpes Simplex VirusⅡ,HSV-2)感染主要引起生殖器疱疹(genital herpes.GH)。具有潜在致癌性,孕妇感染易引起胎儿早产,夭折。近年来GH发病率明显上升,是当前全球范围内对人类健康危害较严重的性传播疾病。HSV-2感染后,感染者终生携带病原体,并以潜伏感染的形式局限在感觉神经后根。该病易复发,目前尚无彻底治愈的方法。由于对其潜伏复发的机理尚不明确,给临床上彻底清除病毒带来了巨大困难。 潜伏相关转录子(Latency Associated transcript,LAT)是HSV在潜伏期间唯一大量存在和被转录的基因,被认为在HSV-2潜伏的建立、维持及激活中起着至关重要的作用。HSV-2的LAT能编码生成9.0Kb的非主要LAT和2.2Kb主要LAT,LAT功能的研究主要集中于对2.2kb主要LAT上,它包含三个开放读码框(Open Reading Frame,ORF)。对于LAT的作用机理,有假说指出LAT通过抗神经元凋亡而发挥潜伏复活功能。 本研究从已成功构建的pVAX-LAT重组载体中克隆抗凋亡可能相关基因ORF2,构建具有绿色荧光标签的重组表达质粒pEGFP-ORF2。研究其在SH-SY5Y和Vero细胞的表达,及对Vero细胞的生物学作用。 首先,根据GenBank中LAT ORFs的核苷酸序列设计引物,从已成功构建的pVAX-LAT重组载体中特异性扩增HSV-2 LAT ORF2片段,将其与真核表达载体pEGFP-C2在体外重组,经单双酶切和测序鉴定,获得重组真核表达质粒pEGFP-ORF2。 将重组真核表达质粒pEGFP-ORF2转染SH-SY5Y/Vero细胞,荧光显微镜检测到ORF2与绿色荧光蛋白的融合表达,RT-PCR检测到ORF2的mRNA表达。G418筛选20天后得到了稳定表达EGFP-ORF2的Vero细胞株。 重组表达质粒pEGFP-ORF2转染Vero细胞,荧光显微镜观察到HSV-2 LAT ORF2诱导细胞形态发生明显变化,绿色荧光蛋白在细胞的定位也发生了改变,MTT法检测到细胞活性降低。可见HSV-2 LAT ORF2对细胞有损伤作用。但5-FU诱导细胞凋亡后,通过荧光显微镜和Giemsa染色观察细胞形态与阳性对照相同, MTT法分析活性率与正常无差异而显著高于阴性对照, DNA ladder未见凋亡条带。Caspase-3活性检测显著低于对照组。由此我们认为HSV-2 LAT ORF2基因在Vero细胞中具有抗5-FU诱导的凋亡作用。 本研究成功构建了pEGFP- ORF2重组质粒,并在SH-SY5Y/Vero细胞内得到有效表达。同时检测了pEGFP- ORF2对Vero细胞的生物学作用,揭示了其抗凋亡的特性,为进一步研究LAT介导的潜伏复发机制奠定了基础。
[Abstract]:Herpes Simplex Virus 鈪，

本文编号：1582788