rAd5-BMP2和rAd5-TGFβ3载体转染诱导滇南小耳猪BMSCs向软骨分化的实验研究

发布时间：2018-03-08 07:39

  本文选题：滇南小耳猪　切入点：BMSCs　出处：《昆明医学院》2010年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 第一部分滇南小耳猪BMSCs体外培养与鉴定 [目的]找到滇南小耳猪骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)高效扩增的方法,以更好地获取软骨组织工程种子细胞。 [方法]用骨穿针抽取滇南小耳猪骨髓,采用离心加贴壁培养法培养。流式细胞仪检测原代、第一代、第二代BMSCs的表面标志物CD29、CD4、CD45。并取第二代BMSCs作成骨和成软骨诱导,用茜苏红、Von kossa染色法检测成骨方向分化的能力,Western blot检测成软骨分化的能力。 [结果](1)细胞形态均为梭形生长,呈成纤维细胞样形态。(2)流式细胞检测P_0CD29阳性率为73.10%,P_0CD44阳性率为69.74%,P_0CD45阴性率为99.68%。P_1CD29阳性率为99.44%,P_1CD44阳性率为99.96%,P_1CD45阴性率为95.81%。P_2CD29阳性率为99.49%,P_2CD44阳性率为99.52%,P_2CD45阴性率为99.93%。(3) BMSCs经成骨诱导三周后茜苏红染色、Von kossa染色均为阳性。(4) BMSCs经软骨诱导三周后Western blot检测Ⅱ胶原阳性。 [结论](1)采用离心加贴壁法培养滇南小耳猪BMSCs是一种高效扩增的方法。(2)第二代滇南小耳猪BMSCs纯度高,可作为组织工程种子细胞。(3)第二代滇南小耳猪BMSCs有多分化潜能,且能向软骨分化,适合作软骨组织工程种子细胞。 第二部分rAd5-BMP2-EGFP和rAd5-TGFβ3载体的构建 [目的]构建rAd5-BMP2-EGFP和rAd5-TGFβ3转染载体。 [方法]PCR扩增BMP2基因；连接PCR产物至T载体中并送交测序；BamHI、EcoRI双酶切鉴定；亚克隆BMP2至穿梭载体PEC3.1-GIE上；通过LR体外同源重组将BMP2表达框转移至pGSadeno腺病毒表达载体上,包装重组腺病毒。荧光显微镜证实rAd5-BMP2-EGFP载体构建成功,并测定病毒滴度。PCR扩增TGFβ3基因；连接PCR产物至T载体中并送交测序；BamHI、EcoRI双酶切鉴定；亚克隆TGFβ3至穿梭载体PEC3.1上；通过LR体外同源重组将TGFβ3表达框转移至pGSadeno腺病毒表达载体上,包装重组腺病毒。PCR验证rAd5-TGFβ3载体构建成功,并测定病毒滴度。 [结果](1)PCR扩增BMP2基因大小为1.2k。(2)连接PCR产物至T载体中并送交测序没有碱基发生突变,无丢失和增加。(3)BamHI、EcoRI双酶切BMP2T载体大小为1.2k.(4)PCR鉴定BMP2 pGSadeno腺病毒表达载体可见1.2k条带。(5)第三轮病毒滴度109pfu/ml,并可以看到明显绿色荧光。(6)PCR扩增TGFβ3基因大小为930 bp。(7)连接PCR产物至T载体中并送交测序没有碱基发生突变,无丢失和增加。(8) BamHI、EcoRI双酶切TGFβ3T载体大小为930 bp。(9)PCR鉴定TGFβ3 pGSadeno腺病毒表达载体可见930 bp条带。(10)第三轮病毒滴度109pfu/ml,PCR鉴定可见514bp条带。 [结论]成功构建出rAd5-BMP2-EGFP和rAd5-TGFβ3载体。 第三部分rAd5-BMP2和rAd5-TGFβ3诱导滇南小耳猪BMSCs向软骨分化 [目的]将rAd5-BMP2和rAd5-TGFβ3转染到滇南小耳猪BMSCs并检测其在BMSCs中的表达,观察双基因转染诱导BMSCs向软骨分化的作用。 [方法]将rAd5-BMP2-EGFP单独转染、rAd5-BMP2-EGFP和rAd5-TGFβ3共同转染到第二代滇南小耳猪BMSCs中,流式检测1、2、3、4天荧光表达率将rAd5-BMP2和rAd5-TGFβ3共同转染、HK(空病毒载体)单独转染到第二代滇南小耳猪BMSCs中及和正常细胞同时培养,观察细胞形态,分别于7、21天取出细胞行Western blot检测BMP2和TGFβ3,三周取出细胞行Western blot检测Ⅱ胶原。 [结果]流式检测rAd5-BMP2-EGFP转染组1、2、3、4天荧光阳性率分别为28.15%、77.84%、81.57%、84.86%; rAd5-BMP2-EGFP和rAd5-TGFβ3转染组1、2、3、4天荧光转染率分别为19.80%、35.26%、78.62%、77.27%。rAd5-BMP2和rAd5-TGFβ3同时转染滇南小耳猪BMSCsWestern blot检测BMP2和TGFβ3呈阳性,Western blot检测转染rAd5-BMP2和rAd5-TGFβ3三周后滇南小耳猪BMSCs的Ⅱ胶原呈阳性。 [结论](1)rAd5-BMP2和rAd5-TGFβ3可同时转染滇南小耳猪BMSCs并有效表达,转染效率在72小时最佳。 (2)BMP2和TGFβ3可诱导滇南小耳猪BMSCs向软骨分化。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：昆明医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R329

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本文编号：1582980