原代和反复传代的骨髓间充质干细胞移植在治疗急性心肌梗死作用中的比较研究

发布时间：2018-03-09 10:14

本文选题：骨髓间充质干细胞　切入点：原代　出处：《南京医科大学》2009年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:为了建立一种骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)移植促进损伤心肌组织修复的更为有效的疗法,我们比较了小鼠原代BM-MSCs和第5代BM-MSCs移植在小鼠急性心肌梗死(MI)模型中的治疗作用。通过体外比较小鼠原代BM-MSCs和第5代BM-MSCs的生物学特征,研究了与反复传代相关的潜在作用机制。同时,我们通过寻找一种大量扩增原代BM-MSCs的行之有效的方法,克服通过反复传代来扩增BM-MSCs的局限性。方法:通过丝线永久结扎C57BL/6J雄性小鼠左冠状动脉前降支,获得左室前壁透壁性急性心肌梗死模型。从β半乳糖苷酶(β-gal~+)转基因小鼠分离骨髓细胞,经“骨髓细胞反复转移(Pour-off)”的方法培养原代β-gal~+ BM-MSCs,再经反复传代培养获取第5代β-gal~+ BM-MSCs,通过心肌内注射移植给小鼠急性心肌梗死模型。移植6周后,对原代BM-MSCs移植组(MI+1st BM-MSCs),第5代BM-MSCs移植组(MI+5th BM-MSCs),造模组(MI)和假手术组(Sham)动物或心肌组织进行超声心动图,组织病理学或免疫印迹分析。同时,从β半乳糖苷酶(β-gal~+)转基因小鼠分离骨髓细胞,经“骨髓细胞反复转移(Pour-off)”的方法培养原代β-gal~+ BM-MSCs,再经反复传代培养获取第5代β-gal~+ BM-MSCs。在体外向心肌和血管内皮细胞进行诱导分化,并通过Real-time RT-PCR检测心肌细胞、血管内皮细胞标记分子的基因表达水平。经PI染色,流式细胞仪检测原代和第5代BM-MSCs的增殖和凋亡情况。同时,通过Real-time RT-PCR检测原代和第5代BM-MSCs的亚全能干细胞标记分子、心肌和组织定向性干细胞的标记分子和基质金属蛋白酶(MMP3、MMP9、MT1-MMP)的基因表达水平。另外,通过二维电泳(2-D)检测原代和第5代BM-MSCs蛋白谱的差异,并对差异蛋白进行质谱(MS)分析。结果:移植6周后,与第5代BM-MSCs相比,原代BM-MSCs在小鼠急性心肌梗死模型有更好的修复作用:能迅速地移入梗死心肌及其边缘带,逐渐在原位进行增殖,形成成熟血管和心肌细胞,促进血管形成,增加梗死区室壁厚度,改善心功能。而且,Akt,磷酸化Akt(phospho-Akt),磷酸化STAT5(phospho-STAT5)在原代BM-MSCs移植组左室前壁梗死心肌表达高于第5代BM-MSCs移植组。总Caspase3(Pro-Caspase3)和激活型Caspase3(Activate-Caspase3)在原代BM-MSCs移植组左室前壁梗死心肌表达低于第5代BM-MSCs移植组。原代BM-MSCs在体外经诱导后,成熟心肌细胞和血管内皮细胞的标记分子表达更高,说明其具有更强的分化潜能。与第5代BM-MSCs相比,原代BM-MSCs具有较强的增殖潜能,不易发生凋亡。而且,亚全能干细胞标记分子、心肌和组织定向性干细胞的标记分子和基质金属蛋白酶的基因表达水平在原代BM-MSCs的表达也明显高于第5代BM-MSCs。有趣的是,由二维电泳(2-DE)胶及双向电泳白金版图像分析软件6.0分析发现:与第5代BM-MSCs蛋白表达谱相比,原代BM-MSCs存在5倍以上差异蛋白点27个。其中,第5代BM-MSCs有24个蛋白下调,3个蛋白上调。通过生物信息学分析及文献查阅发现:原代BM-MSCs与第5代BM-MSCs的差异蛋白主要与加强干细胞粘附、归巢、迁移、增殖、分化能力,促血管发生,抗凋亡,御防氧化应激,或调节炎症和免疫反应有关,而原代BM-MSCs在以上功能方面可能明显优于第5代BM-MSCs。结论:与第5代BM-MSCs相比,原代BM-MSCs具有更好的干细胞特性。对于小鼠急性心肌梗死模型而言,原代BM-MSCs移植在急性心肌梗死治疗中的作用优于第5代BM-MSCs移植。经“骨髓细胞反复转移”的方法培养的原代BM-MSCs的移植,可以作为一种新的治疗策略用于急性心肌梗死后的心肌组织再生。
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【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R329

【参考文献】