胚胎干细胞参与形成的融合细胞对损伤肝细胞作用的研究

发布时间：2018-03-09 19:02

本文选题：融合　切入点：融合细胞　出处：《南京农业大学》2009年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：当人们发现体细胞在体外被诱导通过融合可以被病毒感染的现象后,关于细胞间融合的研究便迅速展开并不断深入。目前,由病毒或化学方法介导的细胞间融合已成为基因表达分析、染色体图谱、抗体生产及癌症免疫治疗的有力工具之一。细胞融合在个体发育、疾病发生和治疗等诸多领域发挥着极其重要的作用,如受精、肌肉、骨骼和胎盘的发育,以及由干细胞调控的组织再生等过程中无不突显它的身影。细胞间融合被认为是干细胞作用于组织再生过程的一种重要机制。诸如肝、肌肉、骨和软骨等组织在损伤后可以重建,机体接受损伤信号后,损伤部位本身的或迁移入损伤部位的干细胞经过增殖和分化后完成组织重建。然而,这种关于重建的理解并不能解释发育过程中干细胞或它们的后代是如何迁至机体最合适部位的?但是,如果是因为干细胞与该组织的实质细胞发生了融合,就可以解释上述问题。融合已被证明是作用于组织再生的一种重要机制。融合后的细胞可以扩增和分裂,修饰后的杂合细胞将成为再生医学和细胞移植疗法的又一新的种子细胞。然而人们对细胞融合过程的了解甚少。在损伤环境中,融合细胞是如何发挥作用的?融合细胞作用的机制是什么?融合细胞在特定的环境中会怎样发生变化?目前还尚未见相关研究的报道。因此,本研究将胚胎干细胞参与形成的融合细胞作为研究对象,探讨融合细胞在损伤微环境中的作用与变化情况。重序论是现今被广泛认可的干细胞作用于组织重建机制的一种学说。通过将体细胞与胚胎源性细胞融合,或通过转导几种多能性相关的关键因子,体细胞的基因组可以被重序。干细胞与分化终末细胞的融合可以重序终末分化细胞的DNA,从而可以调控终末分化细胞的潜能和细胞命运。当异核体形成或“合子”形成后,染色体发生混合(非同源重组)或受到来源于干细胞的细胞因子(包括转录因子)作用后,终末分化细胞的DNA可以发生重序。可见,“合子”的形成会使细胞具有“多能化”的特性从而直接改变其表型。体外实验证明,异核体具有遗传重序的潜能,形成的杂合细胞拥有多能性,与ES细胞的特征相似。因此,基于以上理论,本研究假设,融合后的重编程化的细胞在损伤微环境中,以干细胞的方式作用于组织再生与损伤修复是融合细胞的作用机理。本研究首先建立了体外损伤细胞模型。试验使用氧化损伤剂H202对人胎肝细胞系L-02细胞进行了损伤。如果损伤过于严重,细胞将大量死亡使后继试验无法进行。如果损伤达不到一定程度,细胞自身有修复功能,那么细胞将在短时间内自我修复,这也将影响到后继试验的进行和试验结果的分析。因此,损伤模型的建立进行了多浓度、多时间点的摸索与比较,以筛选到适合的损伤条件。通过分析损伤后细胞的活力、损伤相关酶的分泌及功能性蛋白的分泌,制备了H202作用于L-02细胞的时效量效曲线。最后选择C3=200μM处理2小时为最适损伤浓度和损伤时间,并将其作为最佳损伤条件,建立了L-02细胞的体外损伤模型。融合在组织损伤修复过程中的作用,其中争论最多的是融合发生率问题,很多研究人员都以融合的偶发率作为驳斥融合理论的证据。但是到目前为止,对融合率的确定都是建立在分析特异性标志物的基础上,比如用FISH技术和鉴定Y染色体存在等方法。但是这些检测方法的“丢失率”很高。因此,在本实验中我们将ES细胞与转GOF-18质粒的损伤体细胞共培养后,用最直接的核型分析方法检测损伤微环境中融合的发生率。共培养48小时后,在统计细胞总数及非整倍体细胞中染色体数目后发现,在ES细胞与损伤肝细胞共培养体系中非整倍体的发生率比正常对照组高出近12倍。通过核型分析和荧光检测发现,共培养系统中的非整倍体细胞为两种亲本细胞的融合产物。同时,与对照组相比,损伤相关酶活性检测的结果也显示：共培养以后损伤被明显地抑制了。通过基因表达及蛋白表达分析发现,ES细胞在共培养以后分化成了肝细胞特性细胞。以上结果均说明将ES细胞与损伤的肝细胞直接共培养以后产生了非整倍体的融合细胞,损伤被修复。融合的发生率比以往报道的发生率要高。这暗示了融合在一定程度上对组织的损伤修复是有作用的。本试验中还有一个比较重要的发现,ES细胞在与损伤的肝细胞共培养以后,分化成了肝细胞特性的功能性肝上皮细胞,这为ES细胞的体外定向分化又提供了一种新的方法。同时提示是否分化为组织特异性细胞是重序的融合细胞作用于组织修复的一种方式,因为由ES细胞产生的重序的融合细胞也是多能性的。在证明共培养有利于损伤修复和确定了融合在细胞损伤修复过程中的重要作用以后,为了更深入地研究融合细胞如何在损伤细胞与ES细胞的共培养过程中发挥作用,本试验进一步用PEG诱导的方法,获得了人源转GOF-18质粒的肝细胞与小鼠源ES细胞的融合细胞,并运用多种方法,对融合细胞进行融合鉴定及重序鉴定。筛选得到的融合细胞中,有85%以上的细胞表达了EGFP,证明了融合细胞的形成。融合细胞在器官形成、组织再生和癌形成中都有重要的作用。但是对融合细胞的命运及功能的研究还很少。因此,基于以上的试验结果,试验计划在体外的损伤微环境中研究了融合细胞的命运和功能。有众多的研究都报道来源于多能性细胞和体细胞的融合细胞中,体细胞的基因组会被重序,它们的融合产物具有与胚胎干细胞一样的多能性,因此本研究假设,融合细胞在损伤环境中,会像ES细胞一样发挥作用。基于上述的试验结果,试验将获得的融合细胞与损伤的肝细胞用transwell进行共培养。试验用Annexin-V/PI双染色法、FACS和Western-blot方法对损伤细胞进行了损伤细胞的凋亡状况分析。结果发现,在整个p53相关的凋亡通路中,随着共培养的进行,凋亡促进因子(p53, Bax, BC1-2, caspase-3)呈现级联式的下调,其中,Bax的表达变化最为显著。通过RT-PCR分析,试验发现内源性的Bax在抑制凋亡的过程中起主要作用。与对照组相比,信号通路中的其它因子虽有变化但不明显。这说明在共培养过程中,Bax对凋亡抑制作用是非常重要的。试验证明共培养以后,H202诱导肝细胞的损伤通过抑制细胞凋亡的方式被修复了。,通过与融合细胞的共培养,L-02细胞的凋亡被有效地抑制了,凋亡的抑制可能与Bax相关信号通路相关。通过分析基因表达模式和蛋白表达方式,结果显示融合细胞分化成了肝上皮细胞样细胞,具有分泌功能的肝细胞特性。分化后的融合细胞呈AFP、ALB(肝细胞标记)和CK818(上皮细胞标记)阳性。而且融合细胞中重新表达有转录活性的肝脏特异性的基因不仅有人源的也有小鼠源性的,这证实了本研究的假设：融合细胞可以像ES细胞一样发挥功能,融合细胞具有双向分化的能力。近期相继的研究都报道了将体细胞与干细胞融合后,融合细胞会重序为“干细胞样”细胞,甚至转导入几种关键性因子后体细胞都能在体外被重序为“胚胎干细胞样”细胞。本试验用免疫荧光的方法,再次证实了融合细胞定向地分化成了肝上皮细胞。另外,在分析损伤相关的酶的活性及肝功能蛋白的分泌后发现,与对照组相比,这些酶的活性逐渐趋向于正常的肝细胞的分泌量。ALB分泌的持续增加再次证明了分化的融合细胞为功能性的肝细胞。本试验证明特定的条件下(共培养),重序后的融合细胞有分化成组织特异性细胞的能力,就像ES细胞的定向分化能力一样。在建立了体外细胞氧化损伤模型后,本研究首先通过共培养ES细胞与损伤细胞来分析融合在损伤微环境中的发生情况及其作用。在确定了融合对损伤的修复作用后,试验进一步对融合细胞在共培养环境中的命运和功能进行了分析。结果表明,在损伤的微环境中,融合细胞会像多能性胚胎干细胞一样分化成肝上皮细胞样细胞,抑制损伤细胞的凋亡,促进细胞增殖并修复损伤。本试验首次将融合细胞直接用于损伤修复的研究中,并首次在损伤微环境中对融合细胞命运及功能进行了体外的检测和分析。试验同时还提供了一种胚胎干细胞定向分化的新方法。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R329

【共引文献】