工频磁场诱导FL细胞膜受体聚簇的鞘脂类代谢机制研究

发布时间：2018-03-10 06:08

本文选题：工频磁场　切入点：表皮生长因子受体　出处：《浙江大学》2008年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 工频磁场是一类由50 Hz或60 Hz交变电流所产生的极低频电磁场,它通常存在于工农业电器设备、家用电器及输变电设施周围。伴随电力与电器设备的广泛应用而日益增强的工频磁场已经成为继水、空气和固体垃圾污染之后的第四大环境污染原。作为一类普遍存在的物理刺激因子,有研究表明,工频磁场可诱导生物体产生多种效应,但是外界电磁场究竟是通过何种机制将自身的物理信号传达给生物体,并产生相应的生物学效应,成为生物电磁学研究领域一个亟待解决的难题。我们在以往的研究中发现,一定强度的50 Hz工频磁场可诱导细胞膜表面的受体发生聚簇,包括细胞表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)和肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor,TNFR)等。同时,在同等强度下,工频磁场能够磷酸化胞内应激活化蛋白激酶(SAPK)和P38丝裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)两种关键酶。因此,我们推测细胞膜,尤其是细胞膜受体,可能是电磁场作用于细胞并发生生物信号转导的主要位点之一。研究表明,受体聚簇及其后续信号的转导与细胞膜的脂筏结构(Lipid rafts)以及一种与鞘脂类代谢密切相关的酸性鞘磷脂酶(acid sphingomyelinase,ASM)具有密切的关系。配体诱导的受体聚簇往往是膜受体及其下游信号通路激活的基础,它的发生遵循如下机制:受体与配体结合,使胞内ASM激活并转位至胞膜上,水解脂筏中的鞘磷脂产生神经酰胺,导致脂筏结构的融合,最终使脂筏上相应的受体产生聚簇现象。该机制的阐明为研究各种非配体因素如何作用于靶细胞膜受体的机制提供了新的思路。大量研究表明多种非配体的刺激因素能诱导细胞特定的受体产生聚簇,这其中就包括与工频磁场同为非电离辐射的紫外线UV-C,以及电离辐射γ射线等物理刺激因素,并且这些聚簇现象的产生与配体诱导的受体聚簇遵循了相似的机制。进一步的研究则表明,脂筏结构,特别是其中主要的结构成分鞘脂类物质在其中发挥了重要的作用。作为细胞膜的基本组成成分,鞘脂类物质由一分子长链脂肪酸、一分子鞘氨醇或其衍生物及一分子极性头醇而组成,其种类包括鞘磷脂、神经酰胺、神经节苷脂等。目前,随着对细胞膜信号通路研究的不断深入,发现鞘脂类物质在细胞信号转导等诸多方面也同样扮演着重要的角色,研究人员也不再单纯地认为它们仅仅作为细胞的结构组分,在揭示受体聚簇及其后续信号转导的机制研究中通常受到格外的重视。为了解工频磁场诱导的细胞受体聚簇是否遵循相同的机制,本研究论文以强度为0.4 mT的工频磁场辐照处理人羊膜(FL)细胞,利用激光共聚焦显微镜免疫荧光技术较系统地分析细胞膜脂筏结构与受体聚簇以及酸性鞘磷脂酶之间的相互关系,并首次引入脂类组学(Lipidomics)的高通量技术研究工频磁场对FL细胞鞘脂类代谢的影响。观察脂筏结构在工频磁场诱导FL细胞受体聚簇现象中的作用本部分研究采用免疫组织化学技术结合激光共聚焦显微镜观察,同时引入脂筏结构的抑制剂——制酶菌素(Nystatin)以研究脂筏结构与工频磁场诱导的细胞膜受体聚簇的关系。实验细胞分为Nystatin预处理组和非预处理组,各组又分别设假辐照组,DMSO溶剂对照组,50 Hz 0.4 mT磁场辐照组和表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)阳性对照组,辐照时间为15 min。其中预处理组在各种因素处理前先以60μg/ml的Nystatin处理1 h。结果显示FL细胞经表皮生长因子EGF和0.4 mT工频磁场辐照处理15 min后均能观察到较为明显的EGF受体聚簇现象,围绕细胞表面呈明亮的绿色光点,或形成光带;而假辐照组与DMSO溶剂对照组中FITC绿色荧光标记的EGF受体呈散在均匀分布,无明显的聚簇现象。当细胞经过Nystatin预处理1 h后,脂筏结构遭到破坏,细胞受体聚簇现象均消失或有所减弱。表明0.4 mT工频磁场诱导的FL细胞受体聚簇与脂筏结构具有密切的相关性。观察酸性鞘磷脂酶ASM在工频磁场作用下的转位并与脂筏结构共定位现象本部分研究同样采用免疫组织化学技术结合激光共聚焦显微镜观察方法,将细胞分为假辐照组,50 Hz 0.4 mT磁场辐照组和EGF阳性对照组,辐照时间为15min,结果显示阳性对照组和磁场辐照组中Cy3标记的ASM和FITC标记的脂筏结构在细胞膜表面形成特定的富集区域,并且产生共定位现象,而在假辐照组中基本处于均匀分布状态。经细胞计数,采用Student's T检验显示辐照组与假辐照组之间差异有显著统计学意义(P＜0.01)。表明0.4 mT工频磁场可以诱导FL细胞ASM发生转位,并与脂筏结构共定位。工频磁场辐照对FL细胞鞘脂类代谢的影响本部分研究应用脂类组学高通量质谱分析的方法对工频磁场作用下FL细胞鞘脂类代谢的影响进行探索。FL细胞经0.4 mT工频磁场分别辐照5,15和30 min后与假辐照组细胞一同收集,提取细胞鞘脂样品,采用基质辅助激光解离——飞行时间质谱技术(matrix assisted laser desorption ionization-time of flight MS,MALDI-TOF-MS)分析细胞内鞘脂类物质含量的改变。结果显示,0.4 mT工频磁场作用下出现质荷比m/z 704的峰值,显示有新的神经酰胺产生,代表鞘磷脂的m/z 727的峰值在磁场处理30 min后消失。经0.4 mT工频磁场分别辐照15 min和30 min后还出现一类鞘糖脂物质(ceramide-monohexoside,CMH)。进一步对所有峰值进行定量分析,发现代表神经酰胺的m/z 509,m/z 611以及m/z 705三个的质谱峰在经磁场辐照后表达量上升,其中,m/z 705在各辐照时间下与假辐照组相比差异均有显著统计学意义(p＜0.01,p＜0.05,p＜0.01)。m/z 509与m/z 611分别在15 min、30 min(p＜0.01,p＜0.05)和5 min、30 min(p＜0.05,p＜0.05)与假辐照比差异有显著统计学意义。代表鞘磷脂(sphingomyline,SM)的质谱峰在表达量的变化上不具规律性。该部分结果显示工频磁场作用下可部分增加神经酰胺的生成。结论: 基于本研究条件下所获得的结果,得出以下结论: 1.脂筏结构是工频磁场诱导FL细胞EGFR聚簇发生的平台。 2.工频磁场可诱导FL细胞酸性鞘磷脂酶ASM发生转位,并与脂筏结构产生共定位。 3.工频磁场辐照能诱导FL细胞神经酰胺含量的改变,鞘磷脂的变化不具规律性,其具体的通路尚待进一步的分析。
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【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R363

【参考文献】