骨髓基质干细胞诱导内皮细胞与自体骨髓基质干细胞低氧条件下联合培养后的成骨能力特性

发布时间：2018-03-11 03:32

  本文选题：骨髓基质干细胞　切入点：内皮细胞　出处：《山东大学》2009年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 目的: 自兔骨髓中分离获取高纯度的骨髓基质干细胞(Bone Marrow Stromal Cells,BMSC)并对其进行体外培养、扩增;将部分BMSC向内皮细胞(Endothelial Cells,EC)诱导,并鉴别其表型;观察低氧条件下BMSC及其来源的EC联合培养后,BMSC的增殖情况及体外成骨能力,探讨低氧条件下BMSC与其来源的EC联合培养对其体外成骨能力的影响。 方法: 1.兔骨髓基质干细胞(BMSC)的分离、培养 利用Percoll分离液(相对密度1.077)进行密度梯度离心法从兔骨髓中分离骨髓基质干细胞,进行体外培养扩增。 2.骨髓基质干细胞向内皮细胞的诱导分化、培养和鉴定 采用细胞性状稳定的第二代骨髓基质干细胞消化,吹打均匀,更换培养液为内皮诱导培养液,两三天换液持续诱导,消化传代后,取细胞做CD34免疫细胞化学鉴定其内皮细胞表型。 3.MTT法检测低氧条件下BMSC与其诱导来源的EC联合培养的细胞增殖及活力 取第二代骨髓基质干细胞与其诱导来源的内皮细胞,实验分四组:(1)BMSC常氧培养组;(2)BMSC低氧培养组;(3)BMSC+EC常氧联合培养组;(4)BMSC+EC低氧联合培养组。体外连续培养7天,分别在此7天内用MTT法检测各组细胞的增殖能力,酶标仪测定光密度值(OD值),每个样本设六个复孔,求其平均值并绘制细胞生长曲线。 4.检测低氧条件下BMSC与其诱导来源的EC联合培养的成骨能力 取第三代骨髓基质干细胞与其诱导来源的内皮细胞,实验分四组:(1)BMSC常氧成骨诱导培养组;(2)BMSC低氧成骨诱导培养组;(3)BMSC+EC常氧成骨诱导联合培养组;(4)BMSC+EC低氧成骨诱导联合培养组。96孔板内体外连续诱导培养6天,分别在此6天内用PNPP法检测各组细胞的碱性磷酸酶(ALP)活性的表达,酶标仪测定光密度值(OD值),每个样本设五个复孔,求其平均值,并绘制ALP活性增长曲线;6孔板内四组样本体外连续诱导培养7天,在第7天行茜素红染色,观察矿化结节形成情况。 结果: 1.密度梯度离心结合贴壁获取高纯度的BMSC,且较好保持了细胞的活性,贴壁3天后细胞成长梭形及多角形,五六天后增殖迅速,形成细胞集落。传代后细胞形态更加单一,五六天后即可铺满瓶底。 2.由BMSC诱导来源的原代EC培养三天后,细胞贴壁,五天后明显集落形成,细胞成梭形;传代后,细胞逐渐变大,由长梭形变为多角形,成典型的“铺路石”样内皮细胞形态。传代后的内皮细胞CD34免疫细胞化学染色为阳性。 3.MTT法检测各组细胞增殖及活力显示:第一、二天各组细胞数量无明显增加且统计学上各组间细胞增殖能力没有显著性差异(P＞0.05);第三天后,各组细胞数量显著增加,统计学上低氧培养组的细胞增殖能力均明显高于常氧培养组(P＜0.01),但同条件下的BMSC单独培养组和BMSC+EC联合培养组间的细胞增殖能力没有显著性差异(P＞0.05)。 4.PNPP法检测各组ALP活性表达显示:BMSC+EC低氧成骨诱导联合培养组的ALP活性表达明显高于其他三组(P＜0.05);BMSC低氧成骨诱导培养组高于BMSC常氧成骨诱导培养组(P＜0.05);BMSC+EC常氧成骨诱导联合培养组高于BMSC常氧成骨诱导培养组(P＜0.05);四组样本培养七天后,BMSC+EC低氧成骨诱导联合培养组部分细胞密集生长区有矿化结节形成,茜素红染色呈橘红色,其他三组未见。 结论: 1.BMSC可通过密度梯度离心结合贴壁培养获得。在一定的体外培养条件下,特性稳定,增殖迅速。BMSC在一定条件下可以诱导分化为内皮细胞。 2.在一定时间内,低氧培养可以促进BMSC的增殖;BMSC来源的EC不能促进BMSC的增殖。 3.在一定时间内,低氧培养可增强BMSC的成骨活性;由BMSC来源的EC能够增强BMSC的成骨活性;低氧条件下,BMSC、EC联合培养,BMSC的成骨活性可显著提高。
[Abstract]:Objective:
Since obtaining high purity of isolated rabbit bone marrow stromal stem cells in bone marrow (Bone Marrow Stromal Cells, BMSC) and its in vitro amplification; part of BMSC to endothelial cells (Endothelial Cells EC) induction, and identify the phenotype; the effects of BMSC and its source under hypoxic conditions EC co culture, proliferation and in vitro BMSC osteogenic ability of BMSC under hypoxic conditions and source of EC combined effect of culture on the capacity of osteogenesis in vitro.
Method:
1. isolation and culture of bone marrow stromal cells (BMSC) in rabbits
The density gradient centrifugation was used to separate bone marrow stromal stem cells from rabbit bone marrow by using Percoll separation solution (relative density 1.077).
Induction and differentiation of 2. bone marrow stromal cells to endothelial cells, culture and identification
The second generation of bone marrow stromal cells were stable stem cell digestion, army uniform, the replacement for the endothelial inducing medium cultured for two or three days for liquid continuous induction, after digestion and passage, the cells do CD34 immunocytochemical identification of the phenotype of endothelial cells.
3.MTT assay was used to detect the proliferation and activity of BMSC and its induced EC in hypoxic conditions
The second generation of bone marrow stromal stem cells and induced endothelial cells were divided into four groups: (1) BMSC normoxia group; (2) BMSC hypoxia group; (3) group co cultured in normoxia BMSC+EC group; (4) BMSC+EC co cultured hypoxia. In vitro cultured continuously for 7 days, respectively, in the 7 days was measured by MTT cell proliferation, determination of optical density (OD) eliasa, each sample set up six wells, calculate the average value and drawing the cell growth curve.
4. detection of osteogenesis ability of BMSC and its induced EC under hypoxic condition
The third generation of bone marrow stromal stem cells and induced endothelial cells were divided into four groups: (1) BMSC normoxic osteoblast induced group; (2) BMSC hypoxia induced osteoblast group; (3) BMSC+EC normoxia and osteogenesis co culture group; (4) BMSC+EC hypoxia induced bone lead combined culture group.96 orifice in vitro cultured for 6 days, 6 days respectively in alkaline phosphatase was measured by PNPP cell (ALP) activity expression, determination of optical density (OD) eliasa, each sample set up five wells, calculate the average value, and draw the growth activity of ALP curve; in 6 pore plate four samples of in vitro cultured for 7 days in seventh days, alizarin red staining, observe the formation of mineralized nodules.
Result:
1. density gradient centrifugation combined with adherence to obtain high purity BMSC, and maintained cell viability. After 3 days, cell growth was spindle shaped and polygonal. After five or six days, cell proliferation was rapid, and colony formation was formed. After passages, cell morphology was more single, and five or six days later, it was able to fill the bottom of the bottle.
2. induced by BMSC derived from primary EC after three days of culture, adherent cells, significantly five days after colony formation, spindle cells; after passage, the cells gradually become larger, from fusiform to polygon, a typical cobblestone morphology of endothelial cells. Endothelial cells CD34 immunocytochemistry after passage of the staining was positive.
The proliferation and 3.MTT activity assay showed that the number of first, second days the cells were not significantly increased and statistically between groups of cell proliferation had no significant difference (P > 0.05); third days later, the number of cells in each group increased significantly, statistically hypoxia group cell proliferation were significantly higher than those in normoxia group (P < 0.01), but under the same conditions of BMSC alone to cultivate the ability of joint training group and the proliferation of BMSC+EC cells between groups had no significant difference (P > 0.05).
To detect the activity of ALP 4.PNPP showed that BMSC+EC expression of hypoxia osteogenesis co cultured group ALP activity was significantly higher than the other three groups (P < 0.05); BMSC hypoxia induced osteoblast BMSC group was higher than that of normoxic osteoblast induced group (P < 0.05); normoxia BMSC+EC osteogenic induction group was higher than that of joint training BMSC normoxic osteoblast induced group (P < 0.05); four samples after seven days of culture, BMSC+EC hypoxia osteogenesis cells co culture group dense growth zone mineralized nodule formation, alizarin red staining is orange red, the other three groups were not found.
Conclusion:
1.BMSC can be obtained through density gradient centrifugation combined with adherent culture. Under certain culture conditions,.BMSC is stable and proliferated rapidly. Under certain conditions, it can be induced to differentiate into endothelial cells.
2. during a certain period of time, hypoxia culture can promote the proliferation of BMSC, and the EC derived from BMSC can not promote the proliferation of BMSC.
3., in a certain period of time, hypoxic culture can enhance the osteogenic activity of BMSC. The EC derived from BMSC can enhance the osteogenic activity of BMSC. Under hypoxia, BMSC and EC co culture can significantly enhance the osteogenic activity of BMSC.

【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R329

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