重组pcDNA3.1-hBMP-2转染兔ADSCs体外诱导成骨分化的实验研究

发布时间：2018-03-12 19:00

本文选题：骨形态发生蛋白-2　切入点：脂肪源性干细胞　出处：《遵义医学院》2010年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 目的：构建人骨形态发生蛋白-2基因的真核表达载体-重组质粒pcDNA3.1-hBMP-2,利用脂质体LipofectamineTM 2000介导pcDNA3.1-hBMP-2转染兔脂肪干细胞,从而探讨在自身表达的hBMP.2诱导下兔脂肪干细胞成骨分化的效果,为进一步构建组织工程骨做准备。方法：1、设计和合成引物,并通过PCR扩增hBMP.2基因。2、使用BamHI/EcoRI分别对hBMP-2基因和质粒pcDNA3.1进行酶切,将酶切产物相互连接；经转化、扩增后,抽提质粒进行酶切和DNA测序鉴定。3、取三月龄新西兰大白兔颈背部脂肪组织进行脂肪干细胞的获得并培养、扩增。4、利用脂质体LipofectamineTM 2000分别介导hBMP-2基因和EGFP基因转染第4代脂肪干细胞,并使用浓度为400μg/ml G418对转染后细胞进行筛选。5、通过荧光显微镜下计数转染48h后可发绿色荧光细胞的个数明确瞬时转染效率。6、通过MTT比色法绘制hBMP-2组(实验组)、EGFP组(阴性对照组)及未转染组(空白对照组)细胞的生长曲线。7、用ELISA法定量检测各组第3天、第7天、第14天、第21天的连续三天细胞上清液中的hBMP-2含量。8、成骨分化指标的检测：对转染后连续培养7天的细胞进行Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色；使用ALP活性检测试剂盒分别检测各组第3天、第7天、第14天细胞上清液中的ALP活性；使用2%茜素红对转染后连续培养14天的细胞进行钙结节染色。结果：1、经PCR扩增获得了hBMP-2基因；通过转化扩增抽提出的重组质粒行BamHI/EcoRI酶切后获得约1200 bp和5400bp两个片段；其DNA测序结果与Genbank中报道的hBMP-2基因序列一致。2、脂质体LipofectamineTM 2000可以介导pcDNA3.1-hBMP-2和pcDNA3.1-EGFP成功转染脂肪干细胞,通过计算得出其瞬时转染率为(18.0±0.42)%,并经过浓度为400μg/mlG418筛选后获得了稳定转染的细胞。MTT比色法绘制各组细胞的生长曲线观察表明：脂质体LipofectamineTM 2000介导的目的基因转染对脂肪干细胞的生长、增殖无明显影响。3、连续三天细胞培养上清液hBMP-2 ELISA检测表明hBMP-2组在第3天、第7天、第14天、第21天时的hBMP-2表达量均高于相应时段的EGFP组及未转染组(组间p0.05),且能够稳定表达(组内p0.05)。根据hBMP-2标准蛋白曲线换算,在上述培养时段内,hBMP-2组细胞上清液中的hBMP-2含量约12.36ng hBMP-2(细胞接种浓度8×104个/孔)。4、成骨分化指标：Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色显示hBMP-2组细胞内表达出Ⅰ型胶原,均高于EGFP组及未转染组(p0.05)经碱性磷酸酶活性检测试剂盒检测各组细胞不同时段上清液中的ALP活性发现hBMP-2组均较EGFP组及未转染组高(组间p0.05)且随培养时间延长hBMP-2组ALP的活性逐渐增强(组内p0.05) 2%茜素红对转染后连续培养14天的细胞进行钙结节染色发现仅hBMP-2组有较多橘红色结节,而EGFP组及未转染组无明显发现。结论：成功构建了hBMP-2基因的真核表达载体-重组pcDNA3.1-hBMP-2质粒；利用脂质体LipofectamineTM 2000可以介导hBMP-2基因成功转染ADSCs,并对ADSCs的生长、增殖无明显影响,并可通过G418筛选获得稳定转染的细胞。经转染hBMP-2基因的ADSCs能够稳定高效地表达hBMP-2,并能在自身表达的hBMP-2诱导下向成骨细胞进行分化。
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【学位授予单位】：遵义医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R329

【参考文献】