iASPP在MCF7细胞及C57小鼠胸腺细胞抵抗凋亡中的作用

发布时间：2018-03-19 01:02

  本文选题：ASPP家族　切入点：iASPPsv　出处：《北京协和医学院》2010年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究目的:iASPP是p53凋亡促进蛋白家族(apoptosis stimulating protein of p53, ASPP)的抑制性成员(inhibitory member of ASPP of p53family, iASPP),能够特异性抑制p53的促凋亡活性。iASPPsv是本实验室发现的iASPP短型剪接体,全长407氨基酸,和828氨基酸的iASPP在C端高度同源。研究显示iASPPsv能够抑制p53蛋白对Bax基因启动子的转录。我们构建了稳定表达iASPPsv的人类乳腺癌细胞株,研究了iASPPsv高表达细胞生物学功能及对化疗药物敏感性的改变。 研究方法：构建慢病毒载体pCDH-iASPPsv,感染人类乳腺癌细胞系MCF7,经有限稀释法筛选得到表达iASPPsv的MCF7单克隆和感染pCDH的MCF7单克隆。经VP-16处理后,用MTT法检测细胞的生长抑制率,用流式细胞术检测细胞的凋亡水平,用Real time PCR检测凋亡基因Bax、PUMA、Noxa的mRNA表达水平,Western blot方法检测组蛋白H2AX的水平。 结果：(1)经慢病毒感染和有限稀释法筛选后,得到3个表达iASPPsv的MCF7单克隆,经Western blot检测,证实其iASPPsv的蛋白表达水平高于感染pCDH的MCF7。(2)对iASPPsv在化疗药物VP-16抑制细胞生长中的作用研究发现,细胞经不同浓度VP-16处理24h、48h后,表达iASPPsv的MCF7的生长抑制率显著低于感染pCDH的MCF7。(3)对iASPPsv在化疗药物VP-16诱导细胞凋亡中的作用研究发现,经200μg/mL VP-16处理24h、48h后,表达iASPPsv的MCF7的凋亡水平显著低于感染pCDH的MCF7。(4)进一步对其分子机制的研究发现,经200μg/mLVP-16处理24h、48h后,表达iASPPsv的MCF7中凋亡基因Bax、PUMA和Noxa的mRNA水平显著低于感染pCDH的MCF7。(5)为确定iASPPsv对于药物处理后的细胞中DNA损伤水平的影响,进一步检测药物处理后H2AX的水平,结果显示经200μg/mL VP-16处理24h后,表达iASPPsv的MCF7中H2AX水平高于感染pCDH的MCF7。 结论：iASPPsv能够抵抗VP-16对MCF7的生长抑制作用,抑制促凋亡基因Bax、 PUMA、Noxa的转录和细胞凋亡。iASPPsv可能通过抑制p53相关的凋亡途径降低了细胞对化疗药物的敏感性,但细胞中的DNA双链断裂损伤仍然存在并累积,从而导致恶性肿瘤的发生。 研究目的：iASPP是p53结合蛋白ASPP家族中的一员,能够抑制p53对促凋亡蛋白转录子的转录作用,从而抑制p53诱导的凋亡的水平。我们已证实iASPsv能够减弱VP-16对乳腺癌细胞系MCF7产生的增殖抑制作用,能够减弱经VP-16处理后MCF7中促凋亡基因Bax、PUMA和Noxa的表达水平,进而减弱细胞的凋亡水平,但同时,使细胞中H2AX蛋白的水平升高,显示了细胞中存在更多的DNA双链损伤。为了进一步研究iASPP/iASPPsv在正常细胞中的作用,我们实验室构建了iASPP/iASPPsv转基因小鼠。我们用Dex或VP-16处理iASPP/iASPPsv转基因小鼠胸腺细胞,研究iASPP/iASPPsv拮抗化疗药物诱导凋亡的作用。 研究方法：取野生C57小鼠和iASPP转基因小鼠的胸腺,经小鼠淋巴液分离得到小鼠胸腺细胞。经VP-16或Dex处理后,用MTT法检测细胞的生长抑制率,用流式细胞术检测细胞的凋亡水平,用Westrn blot检测组蛋白H2AX的水平。 结果：(1)经流式细胞术检测野生C57小鼠胸腺细胞和转基因小鼠胸腺细胞的表面抗原,结果显示,二者的分化程度没有显著不同,说明后续实验显示出的差异不是由于细胞分化程度不同引起的；(2)细胞经不同浓度VP-16或Dex处理48h后,转基因小鼠胸腺细胞的生长抑制率低于野生C57小鼠的；(3)经VP-16或Dex处理12h、24h、48h,转基因小鼠胸腺细胞的凋亡程度低于野生C57小鼠的；(4)经0.1μg/mlVP-16或者1nM Dex处理48h后,转基因小鼠胸腺细胞的H2AX含量高于野生C57小鼠胸腺细胞的H2AX水平。 结论：iASPP能够抵抗Dex或VP-16对小鼠胸腺细胞的生长抑制；iASPP能够抑制Dex或VP-16处理后小鼠胸腺细胞的凋亡水平；iASPP的存在导致细胞群体中DNA损伤细胞的比例增加。
[Abstract]:Objective: iASPP is p53 apoptosis protein family (apoptosis stimulating protein of p53, ASPP) inhibitory member (inhibitory member of ASPP of p53family, iASPP), which can promote the apoptosis activity of.IASPPsv specific inhibitor of the p53 is iASPP short type spliceosome discovered by our laboratory, a total length of 407 amino acids and 828 amino acids iASPP at the C end. Research shows that iASPPsv is highly homologous to the transcription of Bax gene promoter p53 protein. We constructed the stable expression of iASPPsv in human breast cancer cell line, on the high expression of iASPPsv cell biology function and sensitivity to chemotherapy drugs.
Research methods: to construct the lentiviral vector pCDH-iASPPsv infection of human breast cancer cell lines MCF7, iASPPsv and MCF7 expression of monoclonal MCF7 monoclonal pCDH infection by limited dilution screening. After VP-16 treatment, with the inhibition rate of MTT cells detected by growth, apoptosis cells were detected by flow cytometry, for the detection of apoptosis the Real time PCR gene Bax, PUMA, Noxa expression level of mRNA Western blot method to detect the level of histone H2AX.
Results: (1) screened by lentivirus infection and limited dilution method, 3 expression of iASPPsv MCF7 by Western blot assay, clone, expression level of iASPPsv protein was higher than that of the confirmed pCDH infection in MCF7. (2) on iASPPsv cell growth inhibition by the study found that in the chemotherapy of VP-16, cells were treated with 24h and treated with different concentrations of VP-16 after 48h, the expression of iASPPsv MCF7 growth inhibition rate of pCDH infection was significantly lower than that of MCF7. (3) found on the apoptosis of iASPPsv in chemotherapy induced by 200 g/mL VP-16, VP-16 24h, 48h, apoptosis, the expression level of iASPPsv MCF7 was significantly lower than that of pCDH infection MCF7. (4) further study on the molecular mechanism of the discovery, by 200 g/mLVP-16 24h, 48h iASPPsv MCF7, the expression of apoptosis gene Bax, PUMA and Noxa mRNA levels were significantly lower than those infected with pCDH MCF7. (5) to determine the drug for iASPPsv The effect of DNA damage level in the treated cells further detected the level of H2AX after drug treatment. The results showed that after 200 g/mL VP-16 treatment of 24h, the H2AX level of MCF7 expressing iASPPsv was higher than that of infected pCDH.
Conclusion: iASPPsv can resist VP-16 MCF7 on growth inhibition, inhibition of apoptosis gene Bax, PUMA, Noxa transcription and apoptosis of.IASPPsv cells via apoptosis correlated with inhibition of p53 reduces the sensitivity of cells to chemotherapeutic drugs, but the cells in DNA double strand break damage still exists and accumulated, leading to malignant tumor the occurrence.
Objective: iASPP is a member of the p53 binding protein of the ASPP family, p53 can inhibit the transcription of the pro apoptotic protein transcripts, thereby inhibiting the apoptosis induced by p53 level. We have confirmed that iASPsv can weaken the inhibitory effect of VP-16 on breast cancer cell line MCF7 proliferation can be reduced after treatment with VP-16 in MCF7 the pro apoptotic gene Bax expression levels of PUMA and Noxa, and then decreased levels of apoptosis cells, but at the same time, increased H2AX protein levels in the cells, showing double strand damage more DNA cells. In order to further study the iASPP/ iASPPsv role in normal cells, our laboratory constructed iASPP/iASPPsv transgenic mice. Using Dex or VP-16 iASPP/iASPPsv transgenic mice thymus cells of iASPP/iASPPsv antagonize apoptosis induced by chemotherapy drugs.
Methods: the thymus take wild C57 mice and iASPP transgenic mice, the mice thymocytes obtained lymph separation. After VP-16 or Dex treatment, the rate of inhibition by MTT method to detect cell growth, apoptosis cells were detected by flow cytometry, Westrn blot protein was detected by H2AX.
Results: (1) the surface antigen detection of wild C57 mouse thymus cells and transgenic mice thymus cells by flow cytometry showed that the differentiation degree of the two did not differ significantly, indicating differences in subsequent experiments showed that is not due to cell differentiation caused by different; (2) cells were treated with different concentrations of VP-16 or Dex 48h, transgenic mice thymus cell growth inhibition rate than the wild C57 mice; (3) after VP-16 or Dex treatment 12h, 24h, 48h, the degree of apoptosis in transgenic mice thymocytes than the wild C57 mice; (4) by 0.1 g/mlVP-16 or 1nM Dex after 48h treatment, H2AX content of transgenic mouse thymus cells the C57 is higher than that of wild mouse thymus cells H2AX level.
Conclusion: iASPP can resist the growth inhibition of Dex or VP-16 on mouse thymocytes. IASPP can inhibit thymocyte apoptosis level after Dex or VP-16 treatment, and the presence of iASPP causes the proportion of DNA damage cells in cell population.

【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R363

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