S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的提纯及应用

发布时间：2018-03-21 14:31

  本文选题：S-腺苷同型半胱氨酸水解酶　切入点：SDS-PAGE电泳　出处：《中南大学》2010年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 目的：为了获得高纯度有活性的SAHH,本实验在表达载体PQE30转化菌株E.coli BL21(DE3)成功构建的基础上,通过大量培养该菌来表达SAHH,利用层析方法来纯化SAHH,建立一套完整的纯化方案,并初步探讨其在生化试剂方面的应用。 方法：1.在37℃以及摇床转速200rpm用1L LB肉汤培养基培养E.coli BL21(DE3),培养至对数期(OD600值约0.5),加入IPTG至浓度为0.5mmol/L诱导表达SAHH,诱导时间10h。 2.采用匀浆法裂解细菌,通过硫酸铵分级沉淀得到蛋白酶SAHH的粗制品,再经Sepharose CL-6B Fast Flow、DEAE Sepharose Fast Flow以及Sephadex G-75层析柱进行细分离。 3.采用SDS-PAGE电泳和蛋白免疫印迹技术鉴定表达及纯化产物。 4.根据循环酶法测定Hcy的原理,相同条件下用已知试剂和替代试剂分别检测相同血清中Hcy含量,并采用配对样本t检验比较差异有无统计学意义。 结果：1.E.coli BL21(DE3)在37℃、摇床转速200rpm、IPTG浓度为0.5mmol/L以及诱导10h的条件下成功表达SAHH。 2.利用层析技术纯化SAHH,获得SDS-PAGE电泳近乎单一蛋白,提纯的酶制剂进行电泳后实施PVDF转膜,转膜结构也是单一条带。 3.通过比较已知试剂和替代试剂检测相同血清中的Hcy含量,结果发现p0.05,差异无统计学意义。 结论：1.用经典的大肠杆菌表达系统成功表达SAHH,表达稳定,操作简便,污染小。 2.本研究成功地分离纯化SAHH,整个提纯过程中SAHH较稳定,无降解。 3.本研究初步证实纯化的SAHH具有一定的活性,在生化试剂应用上有一定的价值。
[Abstract]:Objective: in order to obtain the high purity and activity SAHH, the recombinant plasmid E. coli BL21DE3 was successfully constructed. The strain was cultured in large quantities to express SAHH, and then purified by chromatography, and a complete purification scheme was established. Its application in biochemical reagents was also discussed. Methods at 37 鈩，

本文编号：1644269