创伤弧菌外膜蛋白免疫原性及其免疫刺激复合物对鳗鲡免疫效果的研究

发布时间：2018-03-22 22:25

  本文选题：创伤弧菌　切入点：外膜蛋白　出处：《福建师范大学》2009年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 创伤弧菌(Vibrio Vulnificus)FJ03-X2菌株为本研究室分离、鉴定、保种,属于创伤弧菌Ⅰ型菌株,是欧洲鳗鲡(Anguilla anguilla)的致病菌。该菌株具溶血活性和酪蛋白酶活性,对欧鳗幼鳗(约30克/尾)的半数致死剂量(LD_(50))约为7.1×10~3CFU/尾,并已利用16S rDNA序列比较分析及创伤弧菌溶血素特异性Nested-PCR进行了联合鉴定。 首先本研究分别采用不同的方法分离创伤弧菌外膜蛋白(outer membraneproteins,OMP),比较了各种方法的提取效果,筛选最佳的创伤弧菌外膜蛋白提取方法。制备了兔抗创伤弧菌FJ03-X2全菌血清,并应用SDS-PAGE和Western-blotting分析比较了两种方法提取的外膜蛋白的组分和抗原性。SDS-PAGE结果表明,Sarkosyl法分离的主要外膜蛋白相对分子量集中在66～14kDa之间;相对分子量为38kDa、36kDa的外膜蛋白为高丰度蛋白。用兔抗全菌高免血清进行的Western-blotting结果显示,抗血清能识别绝大多数外膜蛋白组分,说明FJ03-X2菌株的外膜蛋白具有良好的抗原性。其中相对分子量分别为66kDa、47kDa、44kDa、38kDa、36kDa、34kDa的外膜蛋白呈强阳性反应,是主要的免疫原组分。同时对创伤弧菌在不同培养条件下的外膜蛋白产量进行了比较分析,结果说明创伤弧菌外膜蛋白产量与温度和时间存在直接相关性。 其次本研究制备出创伤弧菌外膜蛋白(OMP)免疫刺激复合物(ISCOMs)亚单位疫苗,腹腔注射免疫欧鳗,间接ELISA法测得免疫后第7d、14d、21d、28d、35d、42d所采集的血清抗体效价分别为1:100、1:3200、1:6400、1:12800、1:3200、1:1600,欧鳗的血清抗体应答水平先呈现上升趋势,免疫后第28d达到峰值,之后开始下降;但是在第42d仍能检测到相应抗体。同时在第28d用创伤弧菌进行攻毒,OMP-ISCOMs免疫组的免疫保护力可达到100%;而OMPs免疫组的免疫保护力为70%;对照组全部死亡;说明OMP-ISCOMs具有很强的免疫原性,能诱导欧鳗产生较高的免疫保护性。这与第28d欧鳗血清抗体水平最高也是一致的。免疫印迹结果显示,在印迹膜上对应的位置可检测到OMP的4条主要蛋白条带且免疫反应性强,其相对分子量分别为47kDa、38kDa、36kDa、34kDa。上述试验结果提示,创伤痪，

本文编号：1650689