多糖包覆的脂质体用于疫苗口服传递

发布时间：2018-03-28 17:37

本文选题：疫苗　切入点：口服　出处：《沈阳药科大学》2010年博士论文

【摘要】：与传统的注射接种相比,疫苗的口服接种具有诸多优势,除了可以有效的诱导机体产生黏膜局部和其它黏膜组织免疫应答外,还可以诱导全身产生体液免疫和细胞免疫应答。另外这一给药方式不但在很大程度上提高了接种者的顺应性,还可以消除注射接种带来的疾病传播风险,并节约注射器材和特殊医务人员培训所需的成本费用,在儿童免疫、地区疾病的防治方面显示出突出的优势。因此,研究针对细菌、病毒及寄生虫等病原体的疫苗口服传递系统意义深远。然而,尽管口服疫苗传递具有许多优点,由于肠黏膜表面对抗原的机械清除和抗原吸收细胞的低摄取率,限制了疫苗口服接种的进一步推广和应用。本论文的主要研究目的,是针对疫苗口服传递面临的主要障碍,尝试发展新型脂质载体：棕榈酰甘露聚糖锚定的胆盐脂质体(OPM-coated NaDC-Lip)和N-三甲基壳聚糖包覆的多囊脂质体(TMC-coated MVLs),以期利用其独特的稳定性和靶向性提高疫苗口服传递效率。第一章以牛血清白蛋白(BSA)为模型抗原,建立了脂类样品中蛋白含量的测定方法,即乙醇沉淀-BCA法。该方法主要利用乙醇既能沉淀蛋白又能溶解脂类的特点,在采用BCA法测定蛋白浓度之前,先使用乙醇沉淀蛋白,通过离心的手段将蛋白与脂类分离,消除脂类物质对BCA测定的影响。分析方法结果表明,乙醇沉淀法可有效避免脂类物质对BCA法测定蛋白的干扰,线性关系良好,精密度和回收率符合分析方法要求。第二章采用逆向蒸发法制备胆盐脂质体,优化出的最优处方为总脂量225 mg,胆固醇与磷脂质量比为0.5,脱氧胆酸钠与脂相的摩尔比为0.5,此时制备得到的胆盐脂质体稳定性好,抵抗外界胆盐能力强。制备的胆盐脂质体结构呈类球形,为大单室脂质体,与普通脂质体相比粒径减小,小于200 nm。通过浊度实验、PIN特征光谱实验及脱氧胆酸钠在脂质体膜上的分布实验初步考察了脱氧胆酸钠与磷脂的相互作用,结果表明,一部分脱氧胆酸钠插入到脂质体膜上,当脱氧胆酸钠与脂相的摩尔比为0.5时,有效的脱氧胆酸钠与脂相摩尔比Re为0.26,分配系数K为0.21 mM-1。第三章合成了棕榈酰基对甘露聚糖上羟基的取代度为0.37%的棕榈酰甘露聚糖(OPM),并将OPM锚定在胆盐脂质体上。结果表明,OPM并不破坏胆盐脂质体的内部结构,当OPM/PC的质量比为1.0时,OPM锚定在胆盐脂质体的量达到饱和；OPM的加入会使zeta电位的绝对值降低；OPM与胆盐脂质体的质量比为1.0以上时,可以制备出粒径均匀的OPM锚定的胆盐脂质体；载体的制备过程和所用辅料均不会导致BSA的降解；胆盐脂质体和OPM锚定的胆盐脂质体在PBS (pH7.4)、pH1.2的HCl溶液、1%的胰液和20 mmol·mL-1胆盐溶液中均比较稳定。第四章建立了快速、准确测定小鼠体内抗体的分析方法。结果表明,第4周后,皮下注射免疫BSA溶液得到了较高的IgG滴度水平(6.8±0.6),小鼠口服免疫BSA脂质体组、BSA胆盐脂质体组和OPM包覆的BSA胆盐脂质体组的IgG滴度水平分别为4.2±0.3、5.7±0.4和6.7±0.5,口服免疫BSA溶液组及OPM包覆的空白胆盐脂质体组得到的IgG滴度水平比较低(分别为1.9±0.4和2.1±0.4)。在黏膜免疫应答方面,皮下注射BSA溶液组诱导的IgA滴度水平非常低,与BSA脂质体组相比,BSA胆盐脂质体组和OPM包覆的BSA胆盐脂质体组均诱导了更强的黏膜免疫应答(p0.01); OPM包覆的BSA胆盐脂质体组中IgG2a/IgG1比其他组有所提高(p0.05),表明该组处方具有提高细胞免疫应答的能力。第五章制备牛血清白蛋白多囊脂质体,以粒径和包封率为指标,通过单因素试验优化多囊脂质体的制备工艺并筛选处方。通过壳聚糖与碘甲烷进行季胺化反应合成TMC,结果表明,所得合成产物TMC的三甲基取代度为70.2%。制备了TMC包覆的牛血清白蛋白多囊脂质体,并对包覆条件及理化性质进行了研究,当TMC的浓度为0.5%以上时,就可以对多囊脂质体有效的包覆,且包覆后的多囊脂质体比较稳定,不发生聚集；多囊脂质体的制备过程和TMC包覆的过程均不会导致BSA降解；与未包覆的多囊脂质体相比,TMC包覆的多囊脂质体在人工胃液中更加稳定。免疫学实验结果表明,小鼠口服TMC包覆的牛血清白蛋白多囊脂质体后,在血液中可以检测到较高的IgG水平(5.7±0.4),在唾液和肠液中可以检测到较高的IgA水平(分别为5.2±0.2和5.0±0.3)。制备的载体棕榈酰甘露聚糖锚定的牛血清白蛋白胆盐脂质体和N-三甲基壳聚糖包覆的牛血清白蛋白多囊脂质体可有效的诱导体液免疫应答和黏膜免疫应答,可以作为疫苗口服的有效载体。
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【学位授予单位】：沈阳药科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R392

【参考文献】