人新基因TMEM98在炎症中作用的研究

发布时间：2018-03-31 14:25

  本文选题：TMEM98　切入点：克雷伯杆菌肺炎　出处：《大连医科大学》2014年硕士论文

【摘要】：2008年，国家人类基因组北方研究中心对人类基因组数据库进行生物信息学分析，筛选新的潜在细胞因子编码基因，并进行功能筛选和系统研究，获得若干候选基因，TMEM98（transmembrane protein98）是其中之一。迄今对TMEM家族成员功能知之甚少，作用机制更是鲜有报道。 人TMEM98是没有任何功能性文章报道的新基因，序列已知功能未知，其在多种组织包括免疫系统如脾脏、胸腺、淋巴结、骨髓等广泛表达，推测TMEM-98可能作为重要的免疫调节因子在免疫系统发挥重要作用。另外，TMEM98在受到多种炎性因子刺激后表达上调，表明其可能与炎症的发生、发展密切相关，因此，深入研究TMEM98蛋白，为其将来在炎症治疗中的应用奠定了基础。 目的： 通过急性炎症小鼠模型的建立及体外炎症相关细胞的培养，探索新基因TMEM98在炎症反应中的作用及机制，初步探讨将来在炎症治疗中应用的可行性。 方法： 1.体内实验 细菌培养：肺炎克雷伯杆菌（Klebsiella pneumoniae, Kp）LB固体培养基培养取单菌落至液体培养基，37℃培养7~11h，对数生长期离心收集细菌，生理盐水重悬，分光光度计（波长620nm）测定OD值，调整浓度至107cfu/m（lOD=0.7）。 动物分组：雌性6~8周龄C57BL/6小鼠30只，随机分为正常组（Normal）6只、模型组（Saline+Kp）组12只、实验组（TMEM98+Kp）12只。实验组小鼠尾静脉注射TMEM98蛋白（100ng/只），模型组和正常组小鼠尾静脉注射等体积的生理盐水。1h后戊巴比妥钠（50μg/kg）腹腔麻醉实验小鼠，颈部无菌手术，模型组和实验组气管内注射20μl的Kp悬浊液，正常组给予20μl的生理盐水。 标本采集和检测：注射Kp后24h处死实验动物，分离肺组织，HE染色观察各组小鼠急性肺炎整体情况；肺组织髓过氧化物酶（MPO）活性检测分析各组小鼠肺部中性粒细胞的浸润及活性；RT-PCR检测各组小鼠肺部炎性细胞因子（IL-6，IL-8，TNF-α）mRNA的表达；Western Blotting检测各组小鼠肺部转录因子NF-κB的表达。 2.体外实验 细胞培养、分组和处理：体外培养人脐静脉内皮细胞（Human umbilical veinendothelial cells, HUVECs）和人单核细胞系THP-1细胞，肿瘤坏死因子（Tumornecrosis factor, TNF）-α和细菌脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）刺激培养细胞。细胞分为阴性对照组（PBS）、蛋白（TMEM98）处理组、阳性刺激组（TNF-α/LPS）、刺激物+蛋白组（TNF-α/LPS+TMEM98）。 检测方法：MTT实验检测TMEM98蛋白对HUVECs细胞增殖和毒性的影响；Real-time qPCR检测TMEM98蛋白对HUVECs和THP-1两细胞系炎性细胞因子（IL-6、IL-8、CXCL-2、MCP-1）的mRNA水平的影响；Western blotting检测TMEM98蛋白对HUVECs细胞粘附分子（VCAM-1）、细胞内信号传导分子MAPK8、转录因子NF-κB（P65）的蛋白水平影响。 结果： 1.体内实验结果 小鼠肺组织常规HE染色：模型组肺泡间质水肿，大量炎性细胞浸润，典型急性肺炎表现，实验组仅见少量炎症细胞浸润和少量炎性渗出。提示TMEM98蛋白对急性肺炎有减轻或抑制作用。肺组织匀浆MPO活性检测：模型组MPO活性显著高于正常组（P＜0.05），实验组MPO活性显著低于模型组（P＜0.05）。MPO的活性间接反映局部中性粒细胞浸润程度，提示TMEM98蛋白能显著抑制中性粒细胞的局部浸润，减轻炎症损伤。RT-PCR检测肺组织炎性因子：与正常组相比，细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA水平在模型组显著高于正常组（P＜0.05），在实验组显著低于模型组（P＜0.05）。提示TMEM98蛋白能够显著降低肺组织炎性因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）的mRNA水平，抑制急性肺炎。肺组织蛋白的Western Blotting检测：与正常组相比，模型组NF-κB蛋白水平显著升高（P＜0.05），实验组NF-κB蛋白水平相比于模型组（Saline+Kp）显著降低（P＜0.05）。提示TMEM98蛋白对急性肺炎的抑制作用可能与其降低NF-κB蛋白的水平有关。 3.体外实验结果 MTT法检测TMEM98蛋白对HUVECs细胞的增殖和毒性：增殖方面，TNF组的OD值高于PBS组（P＜0.05），TNF+TMEM98组OD值显著低于TNF组（P＜0.05）。细胞毒性方面各组没有表现出显著差异。提示TMEM98蛋白对TNF-α诱导的HUVECs细胞增殖有显著的抑制作用，对HUVECs的细胞毒性和凋亡没有显著影响（P＞0.05）。Real-time qPCR检测HUVECs及THP-1细胞炎性因子mRNA水平：HUVECs细胞：TNF组与PBS组相比，炎性因子IL-6、CXCL-2、MCP-1的mRNA水平显著升高（P＜0.05），，TNF+TMEM98组IL-6、CXCL-2的mRNA水平显著低于TNF组（P＜0.05）。MCP-1的mRNA水平在TMEM98组显著高于PBS组（P＜0.05），在TNF+TMEM98组显著高于TNF组（P＜0.05）。THP-1细胞：LPS组IL-8、CXCL-2的mRNA水平显著高于PBS组（P＜0.05），LPS+TMEM98组IL-8、CXCL-2的mRNA水平显著低于LPS组（P＜0.05）。提示TMEM98能够显著抑制HUVECs或THP-1细胞在TNF-α或LPS刺激基础上炎性细胞因子的分泌（MCP-1除外）。Western blotting方法检测TMEM98蛋白对HUVECs细胞蛋白的表达情况：TMEM98组与PBS组相比HUVECs细胞NF-κB、MAPK8表达量显著下降（P＜0.05），TNF+TMEM98组与TNF组相比HUVECs细胞NF-κB、MAPK8表达量也显著下降（P＜0.05），说明TNF-α能够上调HUVECs细胞对VCAM-1、NF-κB、MAPK8蛋白的表达，但这种作用能够被TMEM98蛋白抑制，推测TMEM98蛋白对于体内实验炎性细胞因子、炎性蛋白表达的抑制作用与其对NF-κB、MAPK8两条通路的作用密切相关。 结论： 1.TMEM98生物信息学预测其为非经典途径的分泌型蛋白。 2.体内实验通过检测多种细胞因子以及参与局部组织细胞损伤的活性物质，确定了TMEM98能够明显抑制Kp造成的急性肺炎，其中对NF-κB通路的抑制作用是形成整体抑制作用的重要因素之一。 3.体外实验通过检测TMEM98对HUVECs、THP-1两种细胞的增殖和毒性的影响以及多种细胞因子、黏附分子VCAM-1、通路蛋白NF-κB、 MAPK8的表达情况，确定TMEM98蛋白能够显著抑制TNF-α诱导的HUVECs细胞增殖及多种细胞因子的分泌，显著抑制LPS诱导的THP-1细胞多种细胞因子的分泌。这种抑制作用与通路蛋白NF-κB、 MAPK8的下调有关。
[Abstract]:In 2008, China National Center for human genome research on the human genome database by bioinformatics analysis, screening of potential new genes encoding cytokines, and study the function and screening system, obtained some candidate genes, TMEM98 (transmembrane protein98) is one of the few members of the TMEM family. So far on the function of knowledge, the mechanism is rarely reported.
TMEM98 is a new gene without any functional reports, sequence of unknown function, including the immune system such as spleen, thymus, lymph node in a variety of organizations, such as the bone marrow is widely expressed, we suggest that TMEM-98 may be an important immune regulatory factor play an important role in the immune system. In addition, the upregulation of TMEM98 expression under a variety of inflammatory after cytokine stimulation, suggesting that it may be with the occurrence of inflammation is closely related to the development, therefore, in-depth study of the TMEM98 protein, which lays a foundation for its future application in the treatment of inflammation.
Objective:
Through the establishment of acute inflammation mouse model and the cultivation of inflammatory related cells in vitro, we explored the role and mechanism of new gene TMEM98 in inflammatory response, and preliminarily discussed the feasibility of future application in inflammatory therapy.
Method锛

本文编号：1691121