稳定表达人巨细胞病毒蛋白pUL23和pUL49哺乳动物细胞系的建立及鉴定

发布时间：2018-04-01 11:21

  本文选题：人巨细胞病毒　切入点：逆转录病毒　出处：《暨南大学》2010年硕士论文

【摘要】：目的：pUL23和pUL49分别是人巨细胞病毒(human cytomegalo virus HCMV) UL23、UL49基因编码的蛋白。UL23是病毒生长的非必须基因,其表达产物pUL23是病毒皮层蛋白。UL49是病毒的必须基因,其表达产物pUL49也是是病毒皮层蛋白,两种病毒蛋白的功能还不清楚。通常病毒感染宿主细胞之后,其自身编码的蛋白通过与宿主蛋白或病毒蛋白自身蛋白相互作用,影响病毒生长、繁殖及致病过程。因此,大部分病毒蛋白发挥功能的场所是宿主细胞。建立稳定表达HCMV pUL23和pUL49哺乳动物细胞系,将为研究pUL23和pUL49与宿主细胞蛋白的相互作用,及其在病毒生活周期中的作用提供有利工具。 人包皮成纤维细胞(human primary foreskin fibroblasts HFF)和人胚肺成纤维细胞(human embryonic lung fibroblasts HELF)是能够在体外感染HCMV的宿主细胞,原代的细胞病毒感染较好,因此,一般采用原代培养细胞作为HCMV的感染模型。 本课题对在原代培养的哺乳动物细胞中建立稳定表达外源蛋白细胞系的方法进行了深入探讨。 方法： 1.稳定表达HCMV pUL23和pUL49哺乳动物细胞系的建立方法 1)逆转录病毒感染法 ①构建逆转录病毒载体pLEGFP-N1-UL23-FLAG、pLEGFP-N 1-UL49-MYC; ②包装含有pLEGFP-N1-UL23-FLAG、pLEGFP-Nl-UL49-MYC、pLEGFP-N1的逆转录病毒,并感染HFF、HELF细胞； ③分别用100ug/ml、700ug/ml浓度的G418筛选稳定表达pLEGFP-N1-UL23-FLAG. pLEGFP-N1-UL49-MYC、pLEGFP-N1的HFF、HELF细胞。 2)脂质体转染法 ①建真核表达载体pCDNA3.1 (+)-UL23-FLAG; ②质体转染pCDNA3.1 (+)-UL23-FLAG、pCDNA3.1(+)进入HELA细胞； ③用1200ug/ml浓度的G418筛选稳定表达pCDNA3.1 (+)-UL23-FLAG、pCDNA3.1(+)的HELA细胞。 2..稳定表达HCMV pUL23和pUL49哺乳动物细胞系的鉴定 1)RT-PCR鉴定病毒蛋白pUL23、pUL49的表达提取稳定细胞系的RNA,做RT-PCR鉴定,电泳观察结果； 2) Western-blotting鉴定病毒蛋白pUL23、pUL49的表达提取稳定细胞系的蛋白质,用特异性抗体检测； 3)免疫荧光技术胞内鉴定病毒蛋白pUL23、pUL49的表达在稳定细胞系胞内,用特异性的抗体能够检测pUL23、pUL49的表达。 3.病毒在HFF稳定细胞系中生长动力学的检测 1) Towne病毒株能否感染稳定表达pUL23、pUL49 HFF细胞系的检测； 2) Towne病毒株在稳定表达pUL23、pUL49 HFF细胞系中的多步生长曲线。 结果： 1)经双酶切、PCR以及测序鉴定证明逆转录病毒载体pLEGFP-N 1-UL23-FL AG、pLEGFP-N1-UL49-MYC和真核表达载体pCDNA3.1(+)-UL23-FLAG构建成功； 2)通过观察逆转录病毒载体pLEGFP-N1包装出的逆转录病毒,感染HFF、HELF细胞后可见的绿色荧光,表明逆转录病毒包装成功； 3)通过RT-PCR检测发现稳定细胞系能够在RNA水平上表达目的基因； 4) Western-blotting检测发现稳定细胞系能够在蛋白水平上表达目的基因； 5)免疫荧光技术检测发现稳定细胞系胞内能够表达pUL23、pUL49,且pUL23的胞内定位于文献报道相符合。 6)HFF稳定细胞系中Towne的生长动力学与原代HFF细胞没有明显差异。 结论：本文采用逆转录病毒感染的方法克服HFF、HELF原代培养细胞转染难的状况,成功地构建了稳定表达pUL23和pUL49的HFF、HELF细胞系；在RNA水平和蛋白质水平都检测到pUL23和pUL49的表达,并在稳定细胞系观察到pUL23定位在细胞质,pUL49主要定位在细胞核,pUL23与文献报道的定位一致,HFF稳定细胞系中Towne的感染和复制水平与原代HFF细胞没有明显差异。因此,本研究中获得的稳定表达pUL23和pUL49 HFF和HELF细胞系可以作为研究病毒蛋白pUL23和pUL49的工具。
[Abstract]:Objective: pUL23 and pUL49 are the human cytomegalovirus (human cytomegalo virus HCMV UL23), UL49 gene encoding protein.UL23 is a non essential gene for virus growth, the expression product of pUL23 virus tegument protein.UL49 gene virus is a must, the expression product of pUL49 virus is cortactin, two kinds of virus protein function not clear. Usually after virus infection of host cells, its encoding protein with host proteins or virus protein protein interactions, influence virus growth, reproduction and pathogenesis. Therefore, most of the virus protein function is the place of the host cell. The establishment of stable HCMV pUL23 and pUL49 expression in mammalian cell lines, for each other the effects of pUL23 and pUL49 with host cell proteins, and their role in the virus life cycle to provide a favorable tool.
Human foreskin fibroblasts (human primary foreskin fibroblasts HFF) and human embryonic lung fibroblast cells (human embryonic lung fibroblasts HELF) is able to in vitro HCMV infected host cells, better infection of primary cell virus so commonly used cells in primary culture as the infection model of HCMV.
In this study, the method of stable expression of foreign protein cell lines in primary cultured mammalian cells was discussed.
Method锛，

本文编号：1695358