单纯疱疹病毒糖蛋白哺乳动物细胞表达系的建立、纯化鉴定及免疫原性分析

发布时间：2018-04-01 11:34

本文选题：单纯疱疹病毒　切入点：糖蛋白B　出处：《南京医科大学》2010年硕士论文

【摘要】： 人类单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus, HSV)感染在全世界都非常普遍,并且在生命的任何阶段都可能发生。HSV I型感染主要引起生殖器以外的皮肤、粘膜(口腔粘膜)和器官(脑)的感染。HSV II型感染主要引起生殖器部位皮肤粘膜感染。HSV感染人体发病率高,复发率也高,对人体危害严重,可导致不孕、新生儿死亡。现有的抗病毒药物并不能有效的预防HSV原发感染、已经建立的潜伏感染及复发性感染。因此,研制和接种安全有效的HSV疫苗是预防该病毒的理想方法。 HSV包膜糖蛋白在病毒的感染过程中起重要作用,介导病毒与宿主细胞的结合及融合,刺激机体产生免疫应答,在疫苗研制中具有重要地位。其中gB蛋白和gD蛋白在HSV病毒表面数量较多,在病毒的吸附、穿膜、复制等过程中起到不可缺少的关键作用,且具有重要的抗原表位,是宿主细胞进行体液免疫和细胞免疫的主要靶标。因此,糖蛋白gB和gD是理想的HSV候选疫苗抗原。本研究分析筛选HSV I gB、HSV I gD、HSV II gD三种糖蛋白的胞外区片段抗原表位富集区,利用基因工程技术在哺乳动物细胞中分别表达三种重组糖蛋白,检测其生物学活性,为研制重组HSV I型及II型二价疫苗奠定基础。通过对HSV I gB、HSV I gD、HSV II gD三种糖蛋白的抗原表位分析,筛选三种糖蛋白含强抗原表位的较集中的胞外区片段,选择真核和原核生物均偏爱的密码子,优化设计基因的RNA二级结构,化学合成了全新的HSV I gB(gB1)、HSV I gD(gD1)、HSV II gD(gD2)基因序列。将合成的基因片段插入真核表达载体pCEP4内,获得的重组质粒对CHO细胞进行瞬时转染,Western blotting检测培养基上清中表达产物。利用亲和层析方法纯化细胞培养上清。竞争法ELISA测纯化蛋白浓度,直接ELISA法检测其抗原性。将纯化的三种重组糖蛋白,间接ELISA法测血清特异性抗体效价以检测其免疫原性。制备的三种抗gB1、抗gD1、抗gD2抗血清用体外中和试验检测抗体阻断HSV病毒感染宿主细胞的能力。与此同时,将三种重组质粒pCEP4 gB1、pCEP4 gD1、pCEP4 gD2对CHO细胞进行稳定转染,对抗生素筛选得到的含重组质粒的细胞进行单克隆培养,Dot blotting筛选高表达三种糖蛋白的细胞株。实验结果显示,重组糖蛋白gB1、gD1、gD2在哺乳动物细胞中以可溶形式表达,糖基化均一,分子量分别为85kDa、46kDa、46kDa。利用亲和层析技术纯化获得了高纯度的三种重组蛋白,SDS-PAGE及Weatern blotting检测均显示单一条蛋白带。直接ELISA检测显示三种重组糖蛋白具有较好的抗原性和特异性。间接ELISA检测免疫小鼠抗血清中三种抗体效价均≥1:5000,表明重组糖蛋白gB1、gD1、gD2有良好的免疫原性。在固定病毒稀释血清的中和试验中,抗血清样品在1:68稀释度下对HSV I型致Vero细胞病变有抑制作用,在1:20稀释度下对HSV II型致Vero细胞病变有抑制作用。稳定转染后,Dot blotting检测筛选出两株高表达gB1重组糖蛋白的细胞株CHO/pCEP4 gB1 1C12和CHO/pCEP4 gB1 1F7 ;两株高表达gD1重组糖蛋白的细胞株CHO/pCEP4 gD1 C2和CHO/pCEP4 gD1 D3;两株高表达gD2重组糖蛋白的细胞株CHO/pCEP4 gD2 E1和CHO/pCEP4 gD2 G4。
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【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R392

【参考文献】