结核分枝杆菌NrdH-redoxin基因的克

发布时间：2018-04-01 12:02

本文选题：NrdH-redoxin　切入点：分枝杆菌　出处：《西南大学》2010年硕士论文

【摘要】： 结核病是一种严重危害人类健康的传染病。全球近1／3的人口感染过结核菌。人们对结核病的致病菌——结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的生物特性进行广泛研究,继而研发了链霉素、异烟肼、利福平等治疗性药物,使得人类对结核病的控制取得了可喜的成绩,遏制了结核病的蔓延和传播。然而由于化学药物的不合理应用、艾滋病与结核病联合感染、人口流动的增加以及耐药结核病菌的流行,使得近年来结核病疫情下降缓慢,在部分地区甚至有所回升。当前,在结核病控制工作中急需开发出有效的预防性、治疗性疫苗和新型药物。寻找新的结核药物作用靶点和开发新型抗结核药物已成为当前最为关注的热点。结核分枝杆菌是一种胞内致病菌,主要存在于单核吞噬细胞内。单核吞噬细胞产生的ROS (reactive oxygen species)具有强的抗菌活性。因此,当单核吞噬细胞出于防御病菌产生活性基团时,结核分枝杆菌能够发动一个抗氧化的防御系统来清除氧化活性基团,以适应宿主巨噬细胞高度氧化型的环境,并在其中持留和繁殖。结核分枝杆菌具有一系列的氧化还原蛋白来维持细胞内最适的氧化还原内环境,从而抑制脂质的过氧化、DNA交联和抵抗巨噬细胞的氧化攻击等。目前的研究表明这些蛋白包括硫氧还蛋白(thioredoxin, Trx)、过氧化物还原酶(peroxiredoxin,Prx)、烷基过氧化氢还原酶(alkyl hydroperoxide reductase, Ahp)等。此外,结核分枝杆菌中还存在着另一种含有CXXC活性位点基序的蛋白——NrdH-redoxin,该蛋白属于硫氧还蛋白超家族,目前关于该蛋白的研究较少,其在细胞内的生理功能仍有待揭示。因此,开展对该蛋白的功能和性质的研究,有助于进一步了解结核分枝杆菌胞内氧化还原电势的调控及其应对氧化应激的防御机制。本研究主要是对结核分枝杆菌H37Rv的NrdH-redoxin基因nrdH (Rv3053c)的克隆、表达及活性研究,并通过生物信息学对该基因编码蛋白进行结构和功能的分析及预测。从GenBank数据库中获得结核分枝杆菌H37Rv的NrdH-redoxin基因nrdH的核苷酸序列,设计一对引物,以结核分枝杆菌H37Rv全基因组为模板,体外扩增获得nrdH基因。通过TA克隆,将PCR产物连接到pMD19-T Simple Vector,然后亚克隆至载体pET28a(+)中,经菌落PCR、质粒酶切以及序列测定证明成功构建了重组质粒pET2S-nrdH。将重组质粒转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21 (DE3),以温度、时间和IPTG浓度建立三因素三水平的正交实验,对该重组蛋白质诱导表达条件进行优化。使用最佳表达条件进行扩大培养,采用Ni+凝胶亲和层析方法纯化获得高纯度的重组NrdH-redoxin。纯化蛋白的氧化还原活性通过二硫苏糖醇还原牛胰岛素的反应得到证实。我们研究了过表达该酶对宿主菌的影响,包括过表达NrdH-redoxin对宿主菌生长的影响以及过表达NrdH-redoxin的宿主菌对抗氧化压力的耐受性研究。运用Vector NTI 9, SignalP, swiss model等生物信息学资源对NrdH-redoxin的基本性质进行了分析,包括对蛋白一级结构(亲水性／疏水性,跨膜结构和信号肽等)；二级结构以及三级结构等基本性质的预测分析。结果表明：结核分枝杆菌H37Rv NrdH-redoxin无信号肽,不存在跨膜结构区；二级结构是由3个α螺旋及4个β折叠片等构成。同时在一、二级结构分析的基础上,利用同源建模的方法完成了其三维结构的建模。在蛋白质结构库中搜寻模板,发现结核分枝杆菌H37RvNrdH-redoxin的1-72位氨基酸残基肽段与产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)的NrdH-redoxin (PDB登陆号为1r7hA)的序列一致性高达73.611%。利用比较基因组学分析该蛋白在分枝杆菌属中的同源和分布情况,结果显示结核分枝杆菌H37Rv NrdH-redoxin同已报道的其他分枝杆菌属来源的NrdH-redoxin有较高的同源性。NrdH-redoxin的三种特征序列基序在这些物种中都存在,除了三株能降解多环芳烃的分枝杆菌(包括Mycobacterium sp. MCS, Mycobacterium sp. KMS和Mycobacterium sp. JLS)以外,其它分枝杆菌中的序列是高度一致的。进一步分析发现不同分枝杆菌的nrdH基因组合方式也较为保守,nrdH、nrdI和nrdE三个基因紧密相连,很可能是共转录的；在编码核苷酸还原酶(ribonucleotide reductase,RNR)α亚基的nrdE基因和编码核苷酸还原酶β亚基的nrdF基因中间还有两个ORF,主要是假定的转录调控子和单加氧酶。在非致病的分枝杆菌中,nrdH基因的组合方式更为保守,在nrdHIE基因上游普遍存在一个NADPH依赖型的黄素单核苷酸还原酶。但在致病的分枝杆菌中,在nrdH周围的上下游基因中大部分是编码一些功能未知的蛋白,所以其功能也有待进一步研究。综上,本研究为揭示结核分枝杆菌NrdH-redoxin的生理功能及其抗氧化应激机制,并以其作为候选药物靶标,筛选其抑制剂奠定了基础。
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【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R378

【参考文献】