抗SEA卵黄抗体的制备及检测日本血吸虫循环抗原的初步研究

发布时间：2018-04-02 01:02

本文选题：日本血吸虫　切入点：免疫诊断　出处：《南京医科大学》2008年硕士论文

【摘要】： 血吸虫病的免疫诊断主要包括抗体的检测和循环抗原的检测。检测抗体特异性和敏感性均较好,但是抗体在治愈后仍在血清中存在较长的时间,难以区分现症感染与既往感染,即疗效考核价值不高;循环抗原的检测可反映活动性感染,具有较好的病原检测意义和疗效考核价值,但是目前血吸虫循环抗原的检测特异性不高,对慢性感染者的敏感性也低。因此,建立敏感又特异的具有疗效考核价值的循环抗原检测方法是当前血吸虫病基础研究中的一个热点。卵黄抗体(immunoglobulin Y,IgY)是特定抗原免疫母鸡后产生的相应抗体累积并转移至卵黄中而形成,且是卵黄中主要的免疫球蛋白类。与哺乳动物类IgG相比,IgY具有亲和力高、制备简单经济、稳定性好、不激活补体、不结合类风湿因子,也不与哺乳动物类免疫球蛋白分子的Fc受体结合等优点,此外由于与哺乳动物种系发生距离远,IgY不会与哺乳动物类免疫球蛋白发生血清学交叉反应,将其用作免疫诊断试剂可以减少假阳性,提高检测敏感性和特异性。目的:应用抗血吸虫可溶性虫卵抗原(soluble egg antigen,SEA)多克隆IgY和酶标抗SEA单克隆抗体NP28-5B组合,建立一种双抗体夹心法(sandwich ELISA,S-ELISA)检测血吸虫循环抗原,以探讨IgY用于诊断血吸虫病诊断的应用价值。方法: 1.抗日本血吸虫SEA鸡卵黄抗体的制备与鉴定:用日本血吸虫SEA经翅膀下静脉和皮下免疫25周龄海兰母鸡4次(首次剂量为60μg/只,加强剂量为30μg/只),每次间隔10d。取免疫前和首次免疫后35d的鸡蛋卵黄,分别用水稀释法提取纯化IgY。BCA法(2.2′-Bicinohoninic acid.BCA)测定纯化后IgY的浓度,并采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)分析其相对分子量和纯度,间接酶联免疫吸附试验(indirect-ELIsA)检测IgY的活性与特异性。 2.抗SEA单克隆抗体NP28-5B的制备及酶标记:取感染日本血吸虫尾蚴的BALB/c小鼠脾细胞与同系小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合。采用间接ELISA法筛选阳性克隆,阳性孔细胞经反复亚克隆,至所有杂交瘤细胞生长孔的培养上清均能与SEA产生阳性反应为止,此时确认抗SEA单克隆抗体NP28-5B细胞系建立。经传代培养后,收集杂交瘤细胞上清,用50%硫酸铵沉淀后,溶解于10 mM PBS(PH7.4),充分透析后,冻存于-70℃备用。辣根过氧化物酶(HRP)标记NP28-5B(简易过碘酸钠法)。 3.IgY检测日本血吸虫循环抗原双抗体夹心法的建立:以纯化的鸡IgY作为捕获抗体,以HRP标记的NP28-5B为检测抗体建立双抗体夹心酶联免疫吸附试验法(S-ELISA)。运用正交试验对所建立的方法从包被抗体浓度、血清孵育时间、酶标抗体浓度和酶标抗体孵育时间四个方面进行优化。并和常规检测抗体的SEA-ELISA同时检测若干份急、慢性血吸虫病人和健康人血清。 4.感染血清来源:9份急性血吸虫病人血清和45份慢性血吸虫病人血清分别采自江西九江都昌县血防所和云南省大理白族自治州巍山县鼠街乡鼠街村。健康者血清50份取自非血吸虫病流行区的山东省滨州市。结果: 1.海兰母鸡经SEA首次免疫后10d即有特异性IgY产生,加强免疫后效价逐步上升,至35d,每枚蛋经提纯后可得到约61mg抗体,经非还原型SDS-PAGE分析,纯化的IgY有1条主要蛋白带,相对分子量为130000。还原型SDS-PAGE分析结果显示,裂解后的IgY共7条带,其中含有Mr为66000和35000的2条主带。 2.NP28-5B杂交瘤细胞培养上清经50%硫酸铵溶液沉淀、充分透析后所得抗体浓度为61.75mg/ml,间接ELISA法测得抗体有活性;简易过碘酸钠法标记酶后的工作浓度为1:600～1:1000。 3.S-ELISA法测得SEA浓度(y)与吸光度(A450)值(x)在2.25ng/mL～900 ng/mL之间内呈线性关系(r=0.948,1,y=459.22x-108.14),最低的检出限为2.2 5ng。检测急性血吸虫病人循环抗原的阳性率为100.00%(9/9),慢性血吸虫病人循环抗原的阳性率为84.40%(38/45),健康人的特异性为96.00%(48/50)。与SEA-ELISA法对血吸虫病的检出率无统计学意义(P＞0.05)。结论: 1.SEA免疫母鸡后可产生抗SEA的IgY。 2.所建立的S-ELISA法检测日本血吸虫循环抗原有较好的敏感性与特异性,可用于血吸虫病的免疫诊断。
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【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R392

【引证文献】