脉冲电磁场对小鼠胚胎干细胞向成骨细胞分化的作用研究

发布时间：2018-04-02 04:24

  本文选题：组织工程　切入点：胚胎干细胞　出处：《第三军医大学》2009年硕士论文

【摘要】： 研究背景 骨组织工程的关键是成骨细胞成骨以修复骨缺损,其前提是找到良好的种子细胞。目前常用的种子细胞有骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)和胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs),但MSCs在骨髓中所占的比例极低,难以纯化,细胞生物学功能易受传代次数和年龄因素等影响。ESCs来源于哺乳动物的囊胚内细胞团和原始生殖细胞,具有全能分化和无限增殖两大特性。作为最有希望成为骨组织工程的种子细胞,其向成骨细胞定向诱导分化的数量和功能状态是影响组织工程骨的成骨效果的主要因素之一。目前诱导ESCs分化为成骨细胞的方法主要是添加化学诱导剂,然而这种诱导方法的成骨细胞分化率较低,难以满足组织工程对种子细胞巨大数量的要求。 脉冲电磁场(Pulsed electromagnetic fields,PEMFs)作为一种安全、简便、有效的治疗手段已广泛用于临床治疗骨折后骨不连或延迟愈合及假关节等,而且低频、低场强的PEMFs不会导致基因突变及染色体畸变。因此将PEMFs应用于骨组织工程有重要意义。我们前期的研究表明,特定场强和频率的PEMFs能促进骨髓MSCs向成骨细胞分化。考虑ESCs和MSCs在很多方面都有相似性,特别是对相同的成骨诱导剂具有基本相同的反应,所以我们推测脉冲电磁场对ESCs向成骨细胞的分化也起作用。 研究目的 本课题以小鼠ESCs为观察对象,以化学诱导为对照,施加PEMFs刺激,观察其对小鼠ESCs向成骨细胞分化的作用,为探索诱导ESCs向成骨细胞分化的方法提供全新的策略。 材料和方法 1、小鼠胚胎干细胞培养及鉴定:复苏C57BL/6X129小鼠ESCs(广州赛业),以小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast, MEF)为饲养层,在含有白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor, LIF)的培养液中进行扩增培养,并行碱性磷酸酶(AKP)染色检测其未分化性。 2、成骨细胞诱导分化:小鼠ESCs经悬浮培养形成胚胎体(Embryonic Bodies,EBs),在EBs形成第5天收集细胞并按5×104 ml-1的密度接种到细胞培养板,在DMEM基础培养液中使胚胎体单细胞贴壁培养。于EBs分化第5+14d开始,分别给予脉冲电磁场、化学诱导剂以及联合刺激。采用茜素红染色、骨钙素(osteocalcin,OC)免疫组织化学染色、成骨分化关键因子Osterix和Cbfa-1/Runx-2的Real-time PCR检测等方法观测成骨分化情况。 研究结果 1、小鼠胚胎干细胞培养及鉴定 ESCs接种到经γ射线预处理过的饲养层后24h,细胞贴附于MEF上呈克隆性生长,由几个到几十个细胞组成。48h后ESCs克隆体积增大数倍,呈明显的细胞集落。选取生长旺盛的ESCs行碱性磷酸酶染色,克隆呈蓝紫色团块,而饲养层细胞不着色。 2、成骨细胞诱导分化 (1)茜素红染色显示:PEMFs组、诱导培养基组、联合培养组中钙结节面积分别比对照组升高了123%、229%、262%, P0.01。其中,联合培养组与PEMFs组相比,钙结节面积升高了62%,P0.01。联合培养组与诱导培养基组相比,钙结节面积升高了10%,P0.05。 (2)骨钙素免疫组织化学染色显示:PEMFs组、诱导培养基组、联合培养组中可见阳性绿色荧光颗粒,而对照组为阴性。其中又以联合培养组中骨钙素分泌最多。 (3) Real-time PCR检测显示:PEMFs组、诱导培养基组、联合培养组中Osterix的表达水平分别是对照组的1.3(P0.05)、2.2(P0.01)、4.1(P0.01)倍。其中联合培养组中Osterix的表达最高,与PEMFs组和诱导培养基组相比,P0.01,差异具有统计学意义。PEMFs组、诱导培养基组、联合培养组中Cbfa-1/Runx-2的表达水平分别是对照组的1.4(P0.05)、2.1(P0.01)、2.9(P0.01)倍。其中联合培养组中Cbfa-1/Runx-2的表达最高,与PEMFs组和诱导培养基组相比,P0.01,差异具有统计学意义。 研究结论 以γ射线预处理的小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层,结合1000IU/ml的LIF,能有效地维持ESCs的增殖能力和未分化状态。脉冲电磁场可以促进小鼠胚胎干细胞向成骨细胞分化,而且脉冲电磁场和常规化学诱导剂联合应用会产生协同效应,其成骨诱导效果优于两者单独应用。脉冲电磁场促进ESCs向成骨细胞分化的机制可能与BMP-2信号转导通路有关。
[Abstract]:Background of the study



Bone marrow mesenchymal stem cells ( MSCs ) and embryonic stem cells ( ESCs ) are used as the most promising seed cells for bone tissue engineering .



Pulsed electromagnetic fields ( PEM Fs ) have been widely used as a safe , simple and effective method for the treatment of bone fracture and delayed union and pseudoarthrosis .



Purpose of study



In order to explore the role of ESCs in the differentiation of ESCs to osteoblast , a new strategy was provided to explore the way of inducing ESCs to differentiate into osteoblasts .



Materials and Methods



1,灏忛紶鑳氳儙骞茬粏鑳炲煿鍏诲強閴村畾:澶嶈嫃C57BL/6X129灏忛紶ESCs(骞垮窞璧涗笟),浠ュ皬榧犺儦鑳庢垚绾ょ淮缁嗚優(mouse embryonic fibroblast, MEF)涓洪ゲ鍏诲眰,鍦ㄥ惈鏈夌櫧琛，

本文编号：1698781